IDH2突變對神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖及化療敏感性影響研究.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最為常見的腦腫瘤，可根據(jù)WHO組織病理學(xué)與臨床標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ-Ⅳ級。WHOⅣ級是神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，惡性程度最高，具有很強(qiáng)的侵染性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有高發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率和低治愈率的特點(diǎn)，對其徹底性的手術(shù)切除具有極大的難度。目前臨床上主要采取手術(shù)并輔以放化療的治療策略，但治療效果依舊欠佳。腫瘤的發(fā)生與基因突變和代謝紊亂密不可分，對其進(jìn)行基因治療具有廣闊的發(fā)展前景。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴異檸檬酸脫氫酶（isocitrat

2、e dehydrogenase，IDH）在細(xì)胞糖代謝途徑中發(fā)揮著極為重要的作用。3種異檸檬酸脫氫酶分別為IDH1、IDH2和IDH3，均可催化異檸檬酸鹽(isocitrate，ICT)氧化脫羧生成α酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)和還原性輔酶Ⅱ(NADPH)。有文獻(xiàn)報(bào)道在低級別膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中常有IDH1(R132)的突變，沒有IDH1突變的膠質(zhì)瘤則經(jīng)常有IDH2(R172)的突變，IDH1和IDH2的突

3、變都是單一位點(diǎn)氨基酸的突變，IDH2的突變頻率相對IDH1較低。
　?、艻DH1和IDH2均在核內(nèi)編碼，以同型二聚體形式發(fā)揮作用。IDH1突變后形成的異型二聚體(WT∶R132H)明顯降低了IDH1的催化活性，導(dǎo)致酶促反應(yīng)產(chǎn)物α-KG和NADPH的產(chǎn)量也相應(yīng)下降，同時(shí)，突變的IDH1獲得了一項(xiàng)新的酶促活性，能夠催化α-KG和NADPH生成2-羥基戊二酸(2-hydroxyglutarate，2-HG)。IDH1酶活性的獲取與喪失都

4、導(dǎo)致α-KG和NADPH產(chǎn)量的下降。而低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的α亞基(HIF-1α)氧依賴性的泛素化蛋白酶體降解需要α-KG協(xié)助，α-KG產(chǎn)量的下降使得HIF-1α穩(wěn)定性提高，從而使低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)轉(zhuǎn)錄活性提高，激活葡萄糖載體蛋白1(glucose transporter1，Glut1)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)

5、瘤細(xì)胞的增殖。細(xì)胞內(nèi)NADPH水平降低可能會(huì)提高胞內(nèi)氧化性脅迫，從而使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放化療的敏感性提高。
　?、请m然在各類神經(jīng)膠質(zhì)瘤中IDH2突變相對較少，但對IDH2突變的研究是不可被忽視的。實(shí)驗(yàn)首先對大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(C6)的IDH1和IDH2基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)C6中IDH1的R132與IDH2的R172位點(diǎn)均未發(fā)生突變，說明IDH1與IDH2突變對于亞硝基甲基脲誘導(dǎo)產(chǎn)生的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞并不是必需的。隨后對C6細(xì)胞

6、的IDH2定點(diǎn)突變獲得IDH2的常見突變類型R172G，構(gòu)建得重組質(zhì)粒pEGFP-N1-IDH2R172G和pEGFP-N1-IDH2，分別轉(zhuǎn)染C6后，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后12h異源蛋白逐漸開始表達(dá)，24 h-36 h表達(dá)量較高，48 h時(shí)綠色熒光強(qiáng)度減弱。在IDH2酶活性測定實(shí)驗(yàn)中，通過紫外分光光度計(jì)檢測5 min內(nèi)340 nm處的反應(yīng)體系的吸收值，分析各組NADPH的產(chǎn)量變化情況，結(jié)果顯示pEGFP-N1-IDH2M組細(xì)

7、胞內(nèi)NADPH產(chǎn)量低于其它兩組，pEGFP-N1-IDH2WT組NADPH產(chǎn)量高于pEGFP-N1組，表明IDH2突變后，催化異檸檬酸生成α-KG的活性減弱，但可以催化α-KG生成2-HG，兩中反應(yīng)均導(dǎo)致胞內(nèi)NADPH水平的下降，而當(dāng)IDH2WT過量表達(dá)時(shí)，IDH2的酶量提高，從而使得催化產(chǎn)物NADPH的產(chǎn)量提高。
　　⑷在Western blot實(shí)驗(yàn)中，對腫瘤增殖相關(guān)因子低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin

8、D1)和環(huán)氧化酶2(COX-2)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)IDH2突變后，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α穩(wěn)定性提高，Cyclin D1和COX-2的表達(dá)量也明顯提高。表明IDH2突變后，酶活性下降，其催化產(chǎn)物α-KG量減少后，HIF-1α穩(wěn)定性提高，進(jìn)而引起HIF-1α的靶基因Cyclin D1和COX-2表達(dá)量提高。在MTT實(shí)驗(yàn)檢測IDH2突變對C6細(xì)胞增殖活力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)pEGFP-N1-IDH2M組的抑制率總是低于pEGFP-N1和pEGFP-N1-

9、IDH2WT組，說明IDH2突變后，促進(jìn)了C6細(xì)胞的增殖。
　?、衫米贤夥止夤舛扔?jì)分析細(xì)胞內(nèi)GSH含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)pEGFP-N1-IDH2M組的GSH水平低于pEGFP-N1-IDH2WT組，推測IDH2突變后，催化異檸檬酸生成α-KG的活性減弱，但可以催化α-KG生成2HG，而二者都消耗了胞內(nèi)的NADPH，使得胞內(nèi)GSH的量減少，這一結(jié)果可能會(huì)提高細(xì)胞內(nèi)氧化性脅迫，從而使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放化療的敏感性提高。
　　⑹在檢測ID

10、H2突變后C6對化療藥物敏感性變化的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不同藥物濃度處理C6細(xì)胞時(shí)，pEGFP-N1-IDH2WT組的抑制率總是高于其它兩組，并且這一現(xiàn)象對所選用的5種藥物處理情況下普遍存在，推測野生型的IDH2過表達(dá)后，IDH2酶量提高，致使催化產(chǎn)物α-KG水平上升，最終導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定性降低，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。當(dāng)IDH2突變后，酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)α-KG水平降低導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定性提高促進(jìn)細(xì)胞生長的同時(shí)，新的酶活性又進(jìn)一步降低了細(xì)