大豆疫霉無毒基因Avr3α識(shí)別位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位分析.pdf

1、大豆根腐病嚴(yán)重威脅世界范圍內(nèi)的大豆生產(chǎn)，每年在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上都會(huì)造成上高達(dá)二十億美元的損失，而引起這種病害的病原菌就是大豆疫霉。大豆疫霉與真菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，傳統(tǒng)防治真菌的藥物對(duì)其效果不明顯，控制大豆疫霉根腐病的主要措施是培育抗病品種。無毒基因與抗病基因的互相識(shí)別會(huì)直接影響大豆疫霉致病性和大豆的抗病性。目前已有多種抗病基因和無毒基因被鑒定克隆。在大豆疫霉與大豆之間協(xié)同進(jìn)化過程中，大豆疫霉會(huì)通過自身不斷變異來逃避抗病基因的識(shí)別，無毒基因在自然界

2、中的多態(tài)性就是它逃避識(shí)別的一種手段。研究無毒基因的多態(tài)性，尋找關(guān)鍵識(shí)別區(qū)域和位點(diǎn)對(duì)了解大豆疫霉致病機(jī)制，有效控制大豆根腐病具有重要意義。
　　PsAvr3a是已經(jīng)被克隆的大豆疫霉的無毒基因，Avr3a在不同菌株P(guān)6497、P7064、ACR12、HN25、HN35中存在多態(tài)性，但在P7064中不轉(zhuǎn)錄。基于已有的研究結(jié)果，通過基因槍瞬時(shí)表達(dá)首先確認(rèn)Avr3a中20個(gè)氨基酸左右的信號(hào)肽(signalpeptide，SP)對(duì)Avr3a-

3、Rps3a的識(shí)別沒有影響。將P6497、ACR12、HN25、HN35中缺失信號(hào)肽的Avr3a-SP在含有Rps3a的大豆葉片上瞬時(shí)表達(dá)，無毒菌株P(guān)6497、ACR12中的Avr3a能夠被Rps3a所識(shí)別，引起細(xì)胞壞死，而毒性菌株HN25、HN35中的Avr3a中不能被識(shí)別，這表明Avr3a-Rps3a的識(shí)別直接決定了Avr3a的無毒功能。其氨基酸突變位點(diǎn)主要集中在C端W-motif附近區(qū)域，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)77位和82位氨基酸有可能是識(shí)

4、別的關(guān)鍵位點(diǎn)。因此將一系列Avr3a的缺失突變體在含有Rps3a的大豆葉片上瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)識(shí)別關(guān)鍵區(qū)域在第61位到第112位氨基酸的區(qū)域，Wmotif及其前后的區(qū)域?qū)ψR(shí)別都很重要。分別將Avr3aP649777位的天冬氨酸(D)點(diǎn)突變?yōu)楦拾彼?G)，82位組氨酸(H)點(diǎn)突變?yōu)樘於彼?D)，突變體仍被Rps3a識(shí)別，而同時(shí)突變77位的天冬氨酸(D)為甘氨酸(G)，82位組氨酸(H)為天冬氨酸(D)，對(duì)Avr3a與Rps3a的識(shí)別有一定影

5、響。
　　對(duì)Avr3a的亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，Avr3aP6497、Avr3aHN25亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中。將Avr3aP6497的C端分別與核定位信號(hào)（NLS1和NLS2）和核輸出信號(hào)(NES)融合，發(fā)現(xiàn)NLS2、NES都改變了Avr3aP6497的定位而NLS1沒有改變Avr3aP6497的定位;將Avr3aHN25的C端核定位信號(hào)(NLS2)和核輸出信號(hào)(NES)融合，發(fā)現(xiàn)NLS2、NES也改變了Avr3aHN25的定