miR-145作用于靶基因PAK4調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制.pdf

1、目的：
　　本研究擬在體外細(xì)胞水平驗證 miR-145作用的靶基因為 PAK4，明確miR-145通過調(diào)控PAK4而影響腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，進一步探討miR-145/PAK4對下游信號通路LIMK1/cofilin的調(diào)控。
　　方法：
　　1.通過螢光素酶報告基因檢測方法分析miR-145與PAK4間的相互影響。
　　2.構(gòu)建過表達(dá)miR-145、沉默PAK4穩(wěn)定腸癌細(xì)胞株，利用MTT、Transwe

2、ll、Transwell with matrigel方法檢測腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力改變。
　　3.利用western blotting方法檢測 miR-145過表達(dá)和PAK4沉默后對下游LIMK1/cofilin信號通路蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建野生型報告基因質(zhì)粒 psiCHECK2-PAK4-WT和突變型報告基因質(zhì)粒psiCHECK2-PAK4-MUT，過表達(dá)miR-145的質(zhì)粒pCDH-miR-

3、145和空白質(zhì)粒 pCDH-V，將 psiCHECK2-PAK4-WT或psiCHECK2-PAK4-MUT與pCDH-miR-145或pCDH-V共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞株，報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-145能抑制野生型報告基因psiCHECK2-PAK4-WT的螢光素酶活性，但對突變型報告基因psiCHECK2-PAK4-MUT螢光素酶活性無明顯影響。構(gòu)建 pCDH-anti-miR-145質(zhì)粒，將 psiCHECK2-PAK4W

4、T或psiCHECK2-PAK4-MUT與pCDH-anti-miR-145或pCDH-V共轉(zhuǎn)染NCM460細(xì)胞株,報告基因檢測結(jié)果顯示，anti-miR-145能上調(diào)野生型報告基因psiCHECK2-PAK4-WT的螢光素酶活性，但對突變型報告基因psiCHECK2-PAK4-MUT螢光素酶活性無明顯影響。
　　2.構(gòu)建過表達(dá)miR-145的SW1116穩(wěn)定細(xì)胞株和沉默PAK4的SW1116穩(wěn)定細(xì)胞株，利用MTT、Transwe

5、ll、Transwell with matrigel方法檢測過表達(dá)miR-145和沉默PAK4對腸癌細(xì)胞SW1116增殖、遷移、侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)miR-145能抑制腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，沉默PAK4同樣也能抑制腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲。
　　3.利用western blotting方法分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-145后LIMK1和cofilin磷酸化水平明顯降低，沉默PAK4后同樣發(fā)現(xiàn)LIM