葡萄籽原花青素對高血壓心肌纖維化的保護作用及其分子機制的研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 葡萄籽原花青素在自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化中的保護作用及分子調(diào)控機制研究
　　目的:
　　1.研究GSPE對SHR抗心肌纖維化的作用。
　　2.研究cofilin-1介導的GSPE抗SHR心肌纖維化的分子調(diào)控機制。
　　方法:
　　1.實驗動物及分組
　　20周齡雄性SHR大鼠24只，分為(1)高劑量GSPE組(SHRH):250mg/kg/d，灌胃

2、，n=8;(2)低劑量GSPE組(SHRL):100mg/kg/d，灌胃，n=8;(3)對照組(SHRC):生理鹽水，灌胃，n=8。此外，選擇8只WKY鼠做空白對照(WKYC)，對比觀察高血壓的進展。試養(yǎng)一周進入實驗，治療22周末處死動物。
　　2.一般指標的測定
　　(1)血壓及心率檢測:每兩周末及處死前通過BP2006A智能鼠尾無創(chuàng)血壓計檢測各組大鼠尾動脈收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及心率。
　　(2)血液生化指標及

3、心衰指標的測定:實驗前大鼠頸靜脈取血，大鼠處死后心臟取血，檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-C(LDL-C)、N末端腦鈉肽前體(NT-ProBNP)。
　　3.心臟宏觀結構和功能的測定:
　　(1)實驗開始前及GSPE治療22周末采用二維、M超和組織多普勒超聲心動圖技術檢測大鼠的左心室結構、收縮和舒張功能變化。
　　(2)大鼠處死前稱量大鼠體重(body weight，BW)及處死后稱量心臟重量

4、(heart weight，HW)，并計算心臟重量指數(shù)HW/BW(mg/g)。
　　4.心肌病理組織學的測定
　　(1)心肌組織纖維化程度的測定:HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)變化，masson染色觀察膠原纖維面積，天狼星紅染色觀察各型膠原纖維的分布;免疫組化法測定大鼠心肌組織中α-SMA、collagenⅠ的蛋白表達情況;
　　(2)心肌超微結構觀察:透射電鏡觀察心肌組織細胞內(nèi)肌絲、肌節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基復合體等超微結構

5、;
　　結果:
　　1.GSPE對SHR一般情況的影響
　　實驗前，與WKYC組比較，SHR組在體重方面無差異(P＞0.05)，在心率、收縮壓、舒張壓和平均動脈壓方面均顯著升高（P＜0.01），而SHR組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　GSPE治療22周末，與WKYC組比較，SHR各組在體重方面比較仍無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但是，在心率、收縮壓、舒張壓和平均動脈壓方面比較仍均顯著升高(P＜0.01);

6、與SHR對照組比較，SHR治療組在心率、收縮壓、舒張壓和平均動脈壓方面較低(P＜0.05)，但GSPE治療的高低劑量組間無顯著差異(P＞0.05)。
　　GSPE治療前后，實驗鼠各組在血脂及心衰指標方面差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.GSPE對SHR心臟宏觀結構及功能的影響
　　(1)心臟超聲指標:
　　與實驗前比較，GSPE治療22周末，WKYC組舒張功能指標E'/A'顯著下降（P＜0.01），IV

7、Sd顯著增厚(P＜0.01)，LVPWd顯著增厚(P＜0.01)。
　　與實驗前比較，GSPE治療22周末，SHR各組舒張功能指標E'/A'顯著下降（P＜0.01），LVEF升高（P＜0.01或P＜0.05），LVIDd縮?。≒＜0.01或P＜0.05），IVSd顯著增厚(P＜0.01)，LVPWd顯著增厚（P＜0.01）。
　　實驗前，與WKYC組比較:SHR各組E'/A'顯著下降（P＜0.01），IVSd顯著增厚(P＜0

8、.01)。
　　GSPE治療22周末，與WKYC組比較:SHR各組的E'/A'顯著下降(P＜0.01);SHRC組LVEF升高(P＜0.05);SHR各組IVSd增厚(P＜0.01或P＜0.05)，LVPWd顯著增厚(P＜0.01)。
　　GSPE治療22周末，與SHRC比較:GSPE治療組SHR的E'/A'顯著增加(P＜0.01)，LVEF顯著下降(P＜0.01)，LVIDd增大(P＜0.01或P＜0.05)，IVSd變薄

9、(P＜0.05)，LVPWd變薄(P＜0.01)。
　　GSPE治療22周末，SHRH組與SHRL組比較:E'/A'增加(P＜0.05)，LVEF下降(P＜0.05)，IVSd變薄更顯著（P＜0.05），LVPWd變薄更顯著(P＜0.01)。
　　(2)心臟大體標本顯示:與WKYC組比較，SHR各組心臟增大。定量分析心臟重量/體重比值（HW/BWmg/g）。結果顯示:與WKYC組比較，SHR各組均有增高（P＜0.05或P＜0

10、.01）;與SHRC比較，SHR治療組有降低趨勢，但無顯著統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1.GSPE能夠顯著抑制SHR的心肌纖維化，對心肌結構及功能損傷起到保護作用。
　　2.GSPE通過抑制cofilin-1、ROCK1蛋白表達發(fā)揮抗高血壓心肌纖維化的作用。
　　3.SHR心肌中cofilin-1表達顯著增加，且主要分布于心肌間質(zhì)內(nèi)，在MF中具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　第二部分 cofili

11、n-1介導的葡萄籽原花青素抑制心肌成纖維細胞分化和膠原蛋白合成的分子調(diào)控機制
　　目的:
　　1.研究cofilin-1在CFs分化及膠原蛋白合成中的分子調(diào)控機制。
　　2.研究cofilin-1介導的GSPE抑制CFs分化和膠原蛋白合成的分子機制。
　　方法:
　　1.CFs的培養(yǎng)及分化:
　　(1)在時間梯度實驗中，人類CFs(human CFs，HCFs)應用10 ng/ml的TGFβ-1分別刺

12、激0、24、48和72小時;在濃度梯度實驗中，我們應用0、5、10和50ng/ml的TGFβ-1刺激HCFs48小時。收集細胞，提取蛋白，檢測α-SMA和cofilin-1的表達情況。
　　(2)根據(jù)轉染病毒的不同，將細胞分為4組:
　　1)PBS空白對照組:只加PBS，不加其他干預;
　　2)TGFβ-1刺激對照組:僅給予TGFβ-1刺激;
　　3)TGFβ-1刺激+LV-CON-RNAi:轉染攜帶亂序siRN

13、A慢病毒;
　　4)TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi:轉染攜帶CFL-RNAi(28562-1)的慢病毒。
　　1)組給予PBS，2）、3）和4）組給予10ng/ml的TGFβ-1刺激，培養(yǎng)48h，收集細胞。
　　(3)根據(jù)GSPE干預不同，將細胞分為4組:
　　1)TGFβ-1刺激對照組;
　　2)TGFβ-1刺激+LV-CFL1-RNAi;
　　3)GSPE+TGFβ-1刺激+LV-CF

14、L1-RNAi;
　　4)GSPE+TGFβ-1刺激組;
　　1)和2）組單純應用培養(yǎng)基培養(yǎng)，3）和4）組培養(yǎng)基內(nèi)加入GSPE，調(diào)整GSPE濃度為50ug/ml進行培養(yǎng)。各組均給予10ng/ml的TGFβ-1刺激48h，收集細胞。
　　2.倒置熒光顯微鏡:檢測攜帶報告基因GFP的慢病毒轉染效果。
　　結果:
　　1.CFs分化對cofilin-1蛋白表達的影響
　　Cofilin-1蛋白的表達呈CFs

15、分化程度依賴性增加，即隨α-SMA蛋白的表達增強而增強，當α-SMA蛋白的表達最強時，cofilin-1蛋白的表達也最強。
　　α-SMA和cofilin-1蛋白表達呈TGFβ-1刺激時間依賴性增加(P＜0.01);24小時開始α-SMA和cofilin-1蛋白表達開始顯著增高(P＜0.01)，48小時達最高(P＜0.01)，48小時和72小時之間無顯著差異(P＞0.05)。
　　α-SMA和cofilin-1蛋白的表達呈T

16、GFβ-1刺激濃度依賴性增加(P＜0.01);5ng/mlTGFβ-1刺激組α-SMA和cofilin-1蛋白表達開始顯著增高(P＜0.01)，10ng/mlTGFβ-1刺激組表達最高，50ng/ml和10ng/ml TGFβ-1刺激組間上述蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　2.HCFs中慢病毒干擾cofilin-1的效率和效果
　　將CON-RNAi、CFL1-RNAi(28560-1)、CFL1-RNAi(28

17、561-1)及CFL1-RNAi(28562-1)分別轉染HCFs，轉染72小時后觀察慢病毒攜帶的報告基因GFP的表達情況，發(fā)現(xiàn)感染效率均大于70％，進而收集細胞、提取蛋白進行檢測。
　　結果表明， CFL1-RNAi(28560-1)、 CFL1-RNAi(28561-1)及 CFL1-RNAi(28562-1)轉染致cofilin-1蛋白表達分別減少52％、88％和92％，進而篩選出最有效的干擾位點CFL1-RNAi(2856