Cofilin-1在高血壓腎損傷中的作用機(jī)制及葡萄籽原花青素的保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行討論：
　　第一部分 Cofilin-1在高血壓腎損傷中的作用機(jī)制研究
　　背景：
　　腎臟是高血壓靶器官損傷的重要一部分，約1/5的高血壓患者最終出現(xiàn)腎功能異常。高血壓腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活、鹽負(fù)荷增加、血管活性物質(zhì)失衡、遺傳等因素都參與了高血壓的腎臟損傷。炎癥與上述因素互為因果，參與高血壓腎病的發(fā)生發(fā)展。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB

2、)是一種廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，在腎臟疾病的發(fā)病過程中被激活，從而參與調(diào)控炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。靜息狀態(tài)下，無活性的NF-κB存在于胞漿中，各種刺激導(dǎo)致NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與靶基因位點(diǎn)結(jié)合，最終導(dǎo)致下游炎癥因子的表達(dá)升高。NF-κB核轉(zhuǎn)位過程需要借助肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)改變，因此研究細(xì)胞骨架，尤其是肌動(dòng)蛋白微絲系統(tǒng)，是深入認(rèn)識(shí)高血壓腎臟炎癥損傷機(jī)制的重要切入點(diǎn)。
　　絲切蛋白-1(Cofilin1)是一種重要的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它通

3、過切割和解聚肌動(dòng)蛋白微絲調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白微絲動(dòng)力學(xué)及其重組，參與多種生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，Cofilin1參與內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位過程，但是它在腎小管上皮細(xì)胞、高血壓腎病模型中的作用仍然未知。因此，本課題將利用自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHRs)模型及血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激的腎小管上皮細(xì)胞，借助各種組織病理學(xué)染色技術(shù)和分子生物學(xué)手段，研究cofili

4、n-1在高血壓腎病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。這些結(jié)果將為高血壓腎損傷患者的早期防治提供新靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：
　　1.研究自發(fā)性高血壓大鼠的NF-κB活性及炎癥因子的表達(dá)情況，cofilin1的表達(dá)改變情況;
　　2.了解血管緊張素Ⅱ處理的腎小管上皮細(xì)胞炎性表達(dá)情況及cofilin1的改變;
　　3.探索cofilin1參與高血壓腎臟炎癥過程的分子機(jī)制。
　　方法：

5、　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn):21周齡自發(fā)性高血壓大鼠20只及同周齡的wistar-kyoto大鼠(WKYs)10只，隨機(jī)分為3組（每組10只）:SHR-C組（SHR對(duì)照組），SHR-H組（SHR治療組），WKY-C（WKY對(duì)照組）。SHR-H組，即葡萄籽原花青素(grape seedproanthocyanidin extract，GSPE)治療對(duì)照組。SHR-C組及WKY-C組每天給予1ml生理鹽水灌胃，SHR-H組每天給予250mg/kg GSP

6、E灌胃，持續(xù)灌胃22周。實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)尾動(dòng)脈血壓、體重，收集24小時(shí)尿并記錄尿總量，取少量離心后留取上清以備后用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)麻醉動(dòng)物，留取標(biāo)本。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn):體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2），用AngⅡ處理12小時(shí)，觀察monocyte chemotactic protein1(MCP1)、Interleukin-1β(IL-1β)表達(dá)及NF-κB核轉(zhuǎn)位的情況;GSPE預(yù)處理后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，用于初步了解AngⅡ的促炎效果及G

7、SPE的治療效果。構(gòu)建干擾cofilin1表達(dá)的載有cofilin1-shRNA的慢病毒(Lv-cfl-shRNA)，摸索轉(zhuǎn)染條件，驗(yàn)證干擾效率，然后正式轉(zhuǎn)染，獲得cofilin1干擾的細(xì)胞，傳代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用血管緊張素Ⅱ刺激轉(zhuǎn)染了Lv-cfl-shRNA或轉(zhuǎn)染了空白病毒Lv-con-shRNA的HK-2細(xì)胞，觀察應(yīng)力纖維形成、MCP1、IL-1β表達(dá)及NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。
　　1.留取腹主動(dòng)脈血及24小時(shí)尿，離心后取上清，

8、用于后續(xù)血肌酐、尿素氮、24小時(shí)尿蛋白總量等體液學(xué)指標(biāo);
　　2.病理學(xué)檢測(cè):對(duì)大鼠腎臟組織進(jìn)行HE染色，觀察各組大鼠腎組織病理改變;
　　3.免疫組織化學(xué)染色:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察MCP1、IL-1β、NF-κB的表達(dá)情況;
　　4.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn):應(yīng)用MCP1、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)大鼠腎組織勻漿中的含量。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠體重、血壓變化:至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組間大鼠的體重?zé)o統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)差異(P＞0.05)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中（21周齡-43周齡）SHR大鼠的血壓隨著周齡的增長(zhǎng)而升高，且顯著高于同周齡WKY大鼠的血壓;實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與SHR-C組相比，SHR-H組血壓略下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示本實(shí)驗(yàn)中GSPE處理對(duì)大鼠的血壓無明顯影響。
　　2.血清肌酐、尿素氮測(cè)定:三組間比較，血清肌酐、尿素氮均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.24小時(shí)尿蛋白總量:與WKY-C組相比，各SHR組大鼠的

10、尿蛋白總量明顯增高(P＜0.01);與SHR-C組相比，SHR-H組尿蛋白則明顯降低(P＜0.01)。
　　4.腎臟病理學(xué)改變:HE染色顯示，與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠腎小管上皮細(xì)胞水腫較明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多;經(jīng)過GSPE治療無論是炎性浸潤(rùn)還是腎小管水腫都明顯好轉(zhuǎn)。定量計(jì)數(shù)切片中的炎性相關(guān)細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞）發(fā)現(xiàn)，與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組炎癥細(xì)胞明顯增多(P＜0.01);與SHR-

11、C組相比，SHR H組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.SHR大鼠腎臟炎性因子高表達(dá)同時(shí)伴有cofilin1活性降低。
　　2.AngⅡ可以刺激腎小管上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)升高伴cofilin1活性降低。
　　3.Cofilin1通過改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而參與高血壓腎損傷。
　　第二部分 葡萄籽原花青素對(duì)高血壓腎損傷的保護(hù)效應(yīng)研究
　　背景：<

12、br>　　在高血壓動(dòng)物模型中，氧化應(yīng)激是腎臟出現(xiàn)最早的病理變化，貫穿在整個(gè)腎損傷的過程中。高血壓時(shí)，血管緊張素Ⅱ水平升高，刺激腎小球系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞上的NADPH氧化酶產(chǎn)生活性氧簇增多，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并可活化細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB(NF-κB)，繼而導(dǎo)致了炎性因子表達(dá)增多，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增多、降解減少，最終腎小管間質(zhì)發(fā)生纖維化。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可以通過血管緊

13、張素Ⅱ提高腎小球毛細(xì)血管跨膜壓，并且可以攻擊體內(nèi)的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物丙二醛及短鏈羥基使得血管通透性增加，增加蛋白尿。由于氧化應(yīng)激在高血壓腎損傷發(fā)病中的作用越來越明確，有關(guān)抗氧化劑替代治療的研究也進(jìn)一步引起了我們的重視。
　　原花青素是一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物。葡萄籽原花青素(GSPE)是從葡萄籽中萃取分離得到的一種新型高效抗氧化劑，原花青素含量高達(dá)95％，其抗氧化能力是維生素E的50倍，維生素C的20倍。

14、目前研究發(fā)現(xiàn)，葡萄多酚能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓、增加血管的順應(yīng)性并減輕心臟肥厚。此外，我課題組之前研究發(fā)現(xiàn)GSPE有著顯著改善糖尿病大鼠腎損傷的作用。
　　鑒于大量研究結(jié)果中GSPE的抗氧化、抗炎效應(yīng)，第一部分研究中我們已經(jīng)將GSPE用作抗炎藥物治療高血壓大鼠及血管緊張素Ⅱ處理的腎小管上皮細(xì)胞，其腎臟保護(hù)效果是顯著的。為了全面評(píng)估GSPE在高血壓腎損傷中的保護(hù)機(jī)制，我們又進(jìn)行了本部分實(shí)驗(yàn)。
　　目的：
　　1.觀

15、察SHR大鼠腎臟組織學(xué)病變的特點(diǎn)，研究GSPE對(duì)這些病變的治療效果;
　　2.檢測(cè)SHR大鼠腎臟炎癥和纖維化的水平，評(píng)估GSPE在高血壓腎損傷中抗炎、抗纖維化的效應(yīng);
　　3.檢測(cè)SHR大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平，評(píng)估GSPE在高血壓腎損傷中的抗氧化能力。
　　方法：
　　與上部分研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相同，但是新增SHR-L組，即SHR低劑量治療組，即每天給予100mg/kg GSPE灌胃，持續(xù)灌胃22周。實(shí)驗(yàn)期間每隔2周

16、于周末收集24小時(shí)尿并記錄尿總量，取少量離心后留取上清以備后用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)候麻醉動(dòng)物，留取標(biāo)本。
　　1.實(shí)驗(yàn)開始前及實(shí)驗(yàn)過程中每周測(cè)量大鼠體重、大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。
　　2.留取腹主動(dòng)脈血及24小時(shí)尿，離心后取上清，用于后續(xù)血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24小時(shí)尿蛋白、尿微量白蛋白等體液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.GSPE對(duì)于各組大鼠體重、收縮壓的影響:隨著大鼠周齡的增長(zhǎng)，各組大鼠體重呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)，但4組大鼠間

17、體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)。經(jīng)過22周治療后，SHR各組血壓仍明顯高于WKY組，但SHR大鼠各組間血壓并無明顯差異(P＞0.05)。
　　2.GSPE對(duì)于大鼠腎功能的影響:與WKY-C組相比，SHR各組的24小時(shí)尿蛋白總量、尿微量白蛋白水平都明顯升高(P＜0.01)。與SHR-C組相比，SHR-L組及SHR-H組的尿蛋白總量都降低（P＜0.05或P＜0.01)，但SHR-L與SHR-H兩組間沒有差異(P＞0.05)。至于24小