高血壓小血管重構(gòu)的特征性改變及葡萄籽原花青素保護作用的機制研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)足以動脈血壓持續(xù)升高為特點的“心血管綜合征”，也是最常見的慢性病之一，具有病程長、病因復(fù)雜、健康損害和社會危害嚴重等特點，是我國心腦血管病最主要的危險因素和原因，是全世界公認的重大公共衛(wèi)生問題。高血壓病主要的危害是針對重要臟器如心、腦、腎、血管的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器靶官的功能衰竭，危及患者生命安全和生活質(zhì)量，加重家庭和社會的負擔(dān)，一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點之一。血管

2、重構(gòu)既是高血壓病發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，又是靶器官受損的表現(xiàn)，對其進行干預(yù)是目前高血壓病一級預(yù)防和二級預(yù)防的主要策略。
　　血管重構(gòu)(Vascular remodeling，VR)，其作為一個動態(tài)過程，不僅涵蓋細胞的增殖、遷移、凋亡，還包括細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)成分的合成、降解及重排;同時又是血管對各種刺激因子的動態(tài)反應(yīng)過程，包括信號的感知、傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子的合成、釋放，最終血管結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)。

3、最典型的特征包括中膜增厚、內(nèi)徑縮小和基質(zhì)增多，但不同的血管重構(gòu)有不同變化，現(xiàn)認為大動脈血管如主動脈，以血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)肥大為主;小動脈如腸系膜第三級動脈，以增生為主?，F(xiàn)階段缺乏針對高血壓小動脈重構(gòu)機制及干預(yù)的系統(tǒng)性研究。
　　大量血管重構(gòu)研究側(cè)重于血管內(nèi)膜內(nèi)皮細胞和VSMC，我們實驗發(fā)現(xiàn)小動脈血管外膜的細胞成分:成纖維細胞(Adventitia fibroblast

4、，AF)在炎癥和細胞因子等病理刺激下通過激活、腔內(nèi)遷移和表型轉(zhuǎn)化參與并促進血管重構(gòu)，使膠原蛋白過度合成、沉積于血管壁，具有不同于大動脈血管重構(gòu)鮮明的特點;而血管壁細胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)也是小動脈血管重構(gòu)過程中的重要細胞事件。
　　葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidins extracts，GSPE)是當(dāng)今世界公認的清除自由基最有效的天然抗氧化劑。據(jù)報道GSPE能有效治療多種心血管疾病，包括動脈

5、粥樣硬化、心肌再灌注損傷、高血壓及其靶器官損害等，但對血管重構(gòu)的作用，特別是對高血壓小動脈重構(gòu)影響及機制研究鮮有報道。
　　本研究首先觀察比較43周齡自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertensiverat，SHR)主動脈大血管與腸系膜小動脈血管重構(gòu)的不同特點，以小動脈重構(gòu)異于大動脈的特征性改變一膠原增生為切入點，觀察成纖維細胞增生、遷移及表型轉(zhuǎn)化以及動脈重構(gòu)時血管壁細胞凋亡和增殖的情況，從組織、細胞、分子多方面探

6、討小血管重構(gòu)可能的機制并給予不同劑量GSPE長程干預(yù)，探討GSPE對高血壓小血管重構(gòu)的保護機制，以期為研究高血壓小血管重構(gòu)提供新思路和新的藥物作用靶點。
　　第一部分自發(fā)性高血壓大鼠大小血管重構(gòu)的差異性比較
　　研究背景：
　　流行病學(xué)資料證實，因經(jīng)濟迅速崛起導(dǎo)致的生活方式顛覆性地改變，使“生活方式病”發(fā)病率居高不下，其中高血壓病就是最常見的代表性疾病之一。高血壓病相關(guān)的心腦血管疾病，在我國已成為超過腫瘤的兇手，高血壓

7、病的靶器官損害以及不良預(yù)后對國民經(jīng)濟和人民健康造成難以估測的負擔(dān)和損失，是心血管領(lǐng)域所面臨的重大挑戰(zhàn)。
　　血管重構(gòu)是多種危險因素及疾病的病理基礎(chǔ)和靶器官損害。新近研究發(fā)現(xiàn)，動脈結(jié)構(gòu)的異常改變是心血管事件的一項獨立的預(yù)測因子。以增生肥厚為主要特點的高血壓小血管重構(gòu)，形態(tài)學(xué)特征為管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，與實驗證據(jù)豐富的大動脈重構(gòu)具有截然不同的特征性表現(xiàn)?，F(xiàn)階段針對高血壓小動脈重構(gòu)機制及干預(yù)的系統(tǒng)性研究較少。
　　血管重構(gòu)在

8、發(fā)生血管管徑的改變的同時會伴隨血管壁成分的改變:血管壁細胞的增殖及活性改變、凋亡平衡失調(diào)及ECM合成、降解失衡以及分布異常等等。參與血管重構(gòu)的AF所合成分泌的膠原蛋白，是構(gòu)成ECM主要成分的一種非水溶性纖維蛋白，在維持組織器官結(jié)構(gòu)中起決定性作用。血管壁膠原構(gòu)成為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，當(dāng)膠原的合成多于降解、特性構(gòu)型及排列分布的變化是高血壓血管膠原重構(gòu)的根本原因。
　　本實驗以Wista Kyoto大鼠(Wista Kyoto rat，

9、wKY)為正常血壓對照組動物，以SHR為實驗組，觀察對比43周齡SHR主動脈及腸系膜小動脈血管重構(gòu)的各自特征性變化，發(fā)現(xiàn)大動脈血管重構(gòu)以血管壁細胞增生，尤其以血管平滑肌細胞肥大、增生為主:而小動脈以ECM增生為主，尤以外膜膠原增生明顯，同時發(fā)現(xiàn)血管壁細胞凋亡增多可能涉及到血管壁細胞增生和凋亡的平衡情況，共同為高血壓血管重構(gòu)的防治提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　1.比較43周齡WKY和SHR大鼠血壓、體重及血脂、血糖

10、、腎功能的情況。
　　2.從形態(tài)學(xué)、組織、細胞多方面比較SHR主動脈與腸系膜小動脈血管重構(gòu)的不同特點。
　　3.從膠原增生的視角來論證高血壓小血管重構(gòu)的特征性改變。
　　4.評價血管壁細胞凋亡與增生平衡情況在不同血管重構(gòu)中的地位。
　　研究方法：
　　20周齡雄性SHR大鼠30只，隨機分為3組:模型對照組（SHR-C組）10只，GSPE小劑量干預(yù)組（SHR-L組）10只，GSPE大劑量干預(yù)組（SHR-H組）

11、10只。同周齡雄性WKY大鼠（WKY-C組）10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進入實驗。每天清晨WKY-C組和SHR-C組給予1ml0.9％生理鹽水灌胃，而GSPE干預(yù)組分別給予100ug/kg，250ug/kgGSPE1ml灌胃。22周后用10％水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉動物，取血后迅速分離4組大鼠腸系膜小動脈及胸主動脈組織。
　　實驗第一部分比較WKY-C組和SHR-C組胸主動脈和腸系膜小動脈血管重構(gòu)的差異，第二部分將探討

12、GSPE對小血管重構(gòu)的保護作用及內(nèi)在機制。
　　1.實驗期間每周尾套法測量大鼠尾動脈收縮壓并稱重;
　　2.從腹主動脈抽血，離心后取血清進行總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯及血糖、肌酐、尿素氮的測定;
　　3.留取WKY-C、SHR-C兩組大鼠的腸系膜小動脈、主動脈組織，制作石蠟切片進行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色觀察比較大小動脈形態(tài)的變化、天狼猩紅-維多利亞藍染色檢測膠原纖維增生和分布

13、變化、以間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡分析Ⅰ、Ⅲ膠原的分布和表達、透射電子顯微鏡觀察兩種動脈超微結(jié)構(gòu)的變化、TUNEL法及免疫組織化學(xué)法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)分別檢測血管壁細胞凋亡與增生情況、TUNEL-PCNA雙重染色顯示血管壁細胞凋亡與增生平衡情況。并留取組織凍存于-80℃冰箱用于第二部分相關(guān)指標檢測。
　　研究結(jié)果：
　　1.血壓和體重情況
　　隨著實驗進行，SHR-C組收縮壓顯著升高，

14、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而兩組大鼠的體重變化無明顯差異。
　　2.血清血脂及血糖、血肌酐、尿素氮的情況
　　實驗測得兩組大鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三脂及血糖、血肌酐、尿素氮均無顯著性差異(P＜0.05)。
　　3.兩組大鼠大小動脈形態(tài)學(xué)變化
　　3.1.HE染色
　　WKY-C組大鼠腸系膜小動脈及主動脈形態(tài)正常，各層分界清楚，排列規(guī)整。SHR-C組大鼠腸系膜小動脈管壁增厚，管腔狹窄，中

15、層VSMCs排列紊亂，外膜增厚明顯且細胞增生;主動脈管壁增厚以中層增厚最為明顯，VSMCs增生肥大，中層彈性膜排列紊亂、厚薄不均且斷裂，部分內(nèi)膜脫落。
　　3.2.天狼猩紅-維多利亞藍雙染
　　天狼猩紅-維多利亞藍雙染明視野下觀察，WKY-C組大鼠腸系膜小動脈與主動脈均形態(tài)正常，藍綠色彈力板結(jié)構(gòu)清晰，紅色膠原纖維分布正常。SHR-C組腸系膜小動脈及主動脈管壁顯著增厚，紅色膠原纖維重度增生，其中腸系膜小動脈外膜膠原的增生更明顯

16、，其藍綠色單層內(nèi)彈力板無明顯變化;而主動脈膠原增生以中層較明顯，多層彈性纖維板破壞，結(jié)構(gòu)紊亂。形態(tài)學(xué)檢測分析顯示，與WKY-C組相比，SHR-C組小動脈內(nèi)徑(Inner diameter, ID)、血管腔橫截面積(luminal cross-sectional area，LCSA)明顯減小（P＜0.05），血管壁厚度(wall thickness，WT)、血管壁橫截面積(wall cross-sectionalarea，WCSA)、WT

17、/ID、WCSA/LCSA明顯增高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;但主動脈ID、LCSA、WT/ID明顯增大(P＜0.05)，WT、WCSA、WCSA/LCSA亦明顯增高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.兩組大鼠大小動脈膠原纖維的比較
　　Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)定量檢測分析發(fā)現(xiàn)SHR-C組大鼠腸系膜小動脈、主動脈膠原面積百分比均顯著高于WKY-C大鼠(P＜0.01)，以小動脈增多更為明顯。<

18、br>　　5.兩組大鼠大小動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原分布
　　天狼猩紅-維多利亞藍雙染偏振光顯微鏡暗視野下可見:WKY-C組大鼠黃紅色Ⅰ型膠原纖維主要分布于外膜;綠色Ⅲ型膠原主要分布在中膜及外膜。SHR-C組腸系膜小動脈及主動脈管壁膠原纖維明顯增生，排列紊亂，Ⅰ型膠原纖維增生延及中膜，Ⅲ型膠原纖維則彌漫分布于外膜及以外，大小動脈相比，小動脈膠原增加更為顯著，尤以外膜Ⅲ型膠原纖維明顯:大動脈膠原增生主要分布在中膜，以Ⅰ型膠原為主。
　　

19、6.間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原表達WKY-C組大鼠動脈結(jié)構(gòu)正常，可見正常密度的綠色膠原纖維及紅色細胞核。與其相比，SHR-C組動脈管壁明顯增厚，細胞核數(shù)目明顯增多，Ⅰ、Ⅲ型膠原增多，彌漫分布于中膜及外膜。大小動脈相比，小動脈膠原增加最為明顯，尤以外膜顯著，大動脈血管壁細胞核增多明顯，以中膜更為明顯。熒光定量分析結(jié)果(IOD)顯示:與WKY-C組比較，SHR-C組大血管壁(P＜0.05)及小血管壁(P

20、＜0.01)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達均增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，小血管Ⅲ型膠原增生更為明顯。
　　7.兩組大鼠大小動脈超微結(jié)構(gòu)變化
　　透射電鏡下WKY-C組大鼠動脈組織膠原多分布于血管外膜，少量分布于中膜，內(nèi)皮細胞、VSMCs以及外膜的AF形態(tài)正常。SHR-C組血管內(nèi)膜損傷明顯，可見凋亡細胞;腸系膜小動脈中膜VSMCs增生、排列紊亂，外膜膠原纖維增生明顯，伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張的成纖維細胞遷移至中膜，甚至遷移的AF出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化特征:細胞膜下

21、密斑形成;主動脈內(nèi)皮細胞損傷尤為嚴重，部分脫落，基底膜呈蟲蝕樣增生修復(fù)，彈力層斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，VSMCs肥大增生，胞漿內(nèi)細胞器增多，膠原增生主要存在于中膜，外膜AF變化不明顯。
　　8.TUNEL法檢測凋亡細胞
　　TUNEL法檢測各組大鼠血管壁凋亡細胞，凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色。與WKY-C組相比，SHR-C組大鼠腸系膜小動脈組織凋亡細胞明顯增多，凋亡指數(shù)(apop幻ticindex，AI)明顯增大(P＜0.01)，而

22、主動脈壁細胞凋亡AI亦有增多(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　9.免疫組織化學(xué)法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)
　　PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示:增殖狀態(tài)的血管壁細胞核被染成棕黃色。與WKY-C組相比，SHR-C組大鼠大小動脈組織增殖細胞明顯增多，其中腸系膜小動脈組織增殖指數(shù)(proliferation index，PI)增加(P＜0.05)，主動脈組織PI增加更明顯(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　1

23、0.TUNEL-PCNA雙重染色
　　TUNEL法檢測凋亡細胞后再行免疫組織化學(xué)法檢測PCNA陽性細胞，TUNEL標記的陽性表達為棕黃色，PCNA標記的陽性表達為紫色。圖像形象顯示高血壓小動脈血管壁細胞凋亡陽性細胞和PCNA陽性細胞都明顯增多，而小動脈血管壁細胞凋亡占優(yōu)勢、大動脈血管壁細胞增生趨勢更明顯。
　　研究結(jié)論：
　　1.高血壓小動脈存在膠原增生明顯的血管重構(gòu)，以外膜Ⅲ型膠原明顯，伴AF的遷移及表型轉(zhuǎn)化。

24、>　　2.高血壓大血管重構(gòu)血管壁細胞增生更明顯，以中膜平滑肌細細增生為主，符合傳統(tǒng)研究結(jié)果。
　　3.高血壓血管重構(gòu)血管壁細胞增生和凋亡共同存在，但小動脈重構(gòu)以非細胞成分-膠原增生占重要地位。
　　提示高血壓動脈血管重構(gòu)是一個多因素、多種細胞、多種病變共同參與的動態(tài)病理過程，小血管重構(gòu)存在不同于大血管重構(gòu)的以膠原增生明顯的特征性改變。
　　第二部分葡萄籽原花青素對自發(fā)性高血壓大鼠小血管重構(gòu)的保護作用及機制研究
　

25、　研究背景：
　　高血壓病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展和血管重構(gòu)(VR)密切相關(guān)。單純的“降壓達標”并不能完全控制靶器官損害和并發(fā)癥的發(fā)生，靶器官損害甚至可以發(fā)生在血壓升高之前，提示高血壓靶器官損害與血壓水平相關(guān)性并不與早期的理論完全相符;因此探討高血壓血管重構(gòu)機制及其防治，對保證病人的生命安全、提高人類的生存質(zhì)量以及減輕國民經(jīng)濟的壓力意義深遠。
　　研究表明:活性氧(Reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧

26、化應(yīng)激參與了高血壓血管重構(gòu)的各個環(huán)節(jié)，氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)水平增強貫穿高血壓的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激涉及內(nèi)皮功能障礙、炎癥、增生、凋亡、遷移和纖維化，是高血壓血管重構(gòu)重要的觸發(fā)、促進因素。
　　GSPE是主要來源于葡萄籽、具有超強抗氧化活性的多酚類化合物，大量研究資料證實不僅在心血管領(lǐng)域呈現(xiàn)卓越的保護作用，如抗動脈硬化、降壓、降脂，抗心肌缺血再灌注損傷及抗炎、保護血管內(nèi)皮功能等;新近研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性，對多種

27、腫瘤細胞具有殺傷作用，但對高血壓小血管重構(gòu)影響及機制研究鮮有報道。
　　本研究第一部分實驗結(jié)果已發(fā)現(xiàn)膠原增生在小血管重構(gòu)中的重要地位以及小血管壁細胞凋亡增多涉及到血管壁細胞增生和凋亡的失衡并參與小血管重構(gòu)的發(fā)展。在第二部分對比自發(fā)性高血壓大鼠模型對照組(SHR-C)及不同劑量GSPE干預(yù)組，檢測各組動物血壓、血脂、血糖、腎功及氧化應(yīng)激水平的變化，并應(yīng)用光鏡、電鏡等觀察其對小血管重構(gòu)形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及細胞學(xué)的變化，TUNEL法和PCN

28、A分別檢測對血管壁細胞凋亡與增生情況的變化，探討不同劑量GSPE對高血壓小血管重構(gòu)能否起到改善作用;進一步對膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1和凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2表達進行RT-PCR和Western Blot檢測，探討GSPE對高血壓小血管重構(gòu)的保護作用及可能的機制。
　　研究目的：
　　1.研究氧化應(yīng)激水平與高血壓小血管膠原增生重構(gòu)的關(guān)系;
　　2.證實不同劑量GSPE對高血壓小血管膠原增生重構(gòu)的保護作

29、用;
　　3.同時觀察血管壁細胞增生和凋亡與GSPE的關(guān)系;
　　4.從分子水平探討GSPE改善高血壓小血管重構(gòu)的作用機制。
　　研究方法
　　實驗第二部分實驗動物的分組、飼養(yǎng)、給藥及標本留取如前所述:30只20周齡雄性SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為:模型對照組（SHR-C組，n=10），GSPE小劑量干預(yù)組（SHR-L組，n=10），GSPE大劑量干預(yù)組（SHR-H組，n=10）。每天清晨SHR-C組給予

30、1ml0.9％生理鹽水灌胃，而GSPE干預(yù)組分別給予100ug/kg，250ug/kg1ml灌胃。22周后用水合氯醛麻醉動物后，取血后迅速分離各組大鼠腸系膜小動脈組織。
　　1.實驗期間每周尾套法測量尾動脈收縮壓并稱重;
　　2.3組大鼠血樣離心后取血清進行總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯及血糖、肌酐、尿素氮的測定;
　　3.采用Victor1420多功能標記儀即MultilabelCounter測定全部4組大鼠腸系膜

31、小動脈組織上清液活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)、過氧化氫(Hydrogenperoxide，H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)含量。
　　4.留取3組大鼠的腸系膜小動脈組織，HE染色觀察腸系膜小動脈形態(tài)、天狼猩紅-維多利亞藍染色檢測膠原纖維和彈力纖維變化及Ⅰ、Ⅲ型

32、膠原的分布、以間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡分析Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達、通過透射電子顯微鏡觀察3組大鼠腸系膜小動脈超微結(jié)構(gòu)的變化、TUNEL法和PCNA分別檢測對血管壁細胞凋亡與增生情況的影響。并留取組織凍存于-80℃冰箱，匯總實驗第一部分組織標本進行RT-PCR和Western Blot檢測。
　　研究結(jié)果：
　　1.血壓和體重情況
　　在實驗過程中，雖然收縮壓隨著實驗進程逐漸升高，SHR-C組與兩個G

33、SPE干預(yù)組相比，組間收縮壓差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);3組大鼠的體重變化無明顯差異。
　　2.血清血脂及血糖、血肌酐、尿素氮的情況
　　實驗測得3組間大鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三脂及血糖、血肌酐、尿素氮均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.檢測4組大鼠腸系膜小動脈氧化應(yīng)激指標
　　與WKY-C組相比，SHR-C組腸系膜小動脈組織中ROS、H2O2、MDA含量顯著升高，SOD、CAT活性顯

34、著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)GSPE干預(yù)后，SHR-H組ROS(P＜0.05)、H2O2及MDA(P＜0.01)降低， SOD(P＜0.01)、CAT(P＜0.05)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而SHR-L組僅ROS、H2O2含量明顯下降(P＜0.05)，且H2O2含量的下降在兩干預(yù)組間也有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），提示GSPE抑制氧化應(yīng)激呈劑量依賴性趨勢。
　　4.大鼠腸系膜小動脈形態(tài)學(xué)變化
　　4.1.HE

35、染色顯示:SHR-C組大鼠腸系膜小動脈呈明顯血管重構(gòu)征象:管壁增厚，管腔狹窄，平滑肌肥大增生，排列紊亂。SHR-L及SHR-H兩組腸系膜血管重構(gòu)征象有所改善，尤以SHR-H組明顯，管壁厚度和管腔狹窄程度明顯減輕，血管內(nèi)膜較光滑，平滑肌增生，排列欠規(guī)則。
　　4.2.天狼猩紅-維多利亞藍雙染明視野下觀察:SHR-C組腸系膜小動脈壁顯著增厚，管腔狹窄，藍綠色單層內(nèi)彈力板無明顯增厚，管壁紅色膠原纖維重度增生，主要分布于中膜及外膜;GSP

36、E干預(yù)組有所改善:劑量依賴性地出現(xiàn)管壁變薄、管腔增大，血管壁膠原纖維增生減輕，尤以高劑量組（SHR-H組）明顯。經(jīng)過Olympus DP72光學(xué)顯微鏡進行圖像采集，Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)進行定量檢測分析顯示:與SHR-C組相比，SHR-H組ID、LCSA明顯增大(P＜0.05)，而WT、WT/ID、WCSA、WCSA/LCSA明顯減小（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義:SHR-L組僅WT、WT/ID、WCSA、WCSA

37、/LCSA明顯減小(P＜0.01)，提示GSPE改善小血管重構(gòu)形態(tài)學(xué)的劑量依賴性趨勢。
　　5.3組大鼠腸系膜小動脈膠原、彈力纖維的比較
　　天狼猩紅-維多利亞藍雙染明視野下觀察，SHR-C組腸系膜小動脈管壁明顯增厚，管腔內(nèi)徑減少，藍綠色單層內(nèi)彈力板有所增厚，中膜、外膜紅色膠原纖維重度增生，且排列紊亂，甚至斷裂;而GSPE干預(yù)組劑量依賴性地呈現(xiàn)管壁增厚減輕，管腔內(nèi)徑增大，藍綠色單層彈力板變化不明顯，血管壁紅色膠原纖維減少，排

38、列仍欠整齊，以高劑量組改善更明顯，但藍綠色單層彈力板變化不明顯;Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)定量檢測分析發(fā)現(xiàn)，GSPE干預(yù)后兩組大鼠腸系膜小動脈膠原面積百分比顯著低于SHR-C組大鼠(P＜0.05)，彈性纖維面積百分比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，膠原纖維面積與彈性纖維面積比值SHR-L組(P＜0.05）、SHR-H組（P＜0.01）均增高;差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　6.大鼠腸系膜小動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原分布情況
　　天

39、狼猩紅-維多利亞藍雙染偏振光顯微鏡暗視野下可見:SHR-C組腸系膜小動脈管壁膠原纖維明顯增生、增粗，排列紊亂，黃紅色增生的Ⅰ型膠原纖維主要分布在外膜并延及中膜，綠色Ⅲ型膠原纖維則彌漫分布于中膜、外膜及外緣;而GSPE干預(yù)組呈現(xiàn)劑量依賴性的血管壁膠原纖維增生減輕，尤以中膜和外膜Ⅲ型膠原纖維減少明顯，中膜內(nèi)Ⅰ型膠原也明顯減少，膠原排列仍欠規(guī)整。
　　7.間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原表達間接免疫熒光組

40、織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡下可見:SHR-C組腸系膜小動脈管壁明顯增厚，綠色膠原增生，紅色細胞核數(shù)目增多，管腔狹窄，Ⅰ型膠原纖維增多，彌漫性分布于中膜及外膜，Ⅲ型膠原亦增多，主要分布于外膜及外緣;而GSPE干預(yù)組血管壁增厚減輕，細胞核數(shù)目減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原均減少。熒光定量分析(IOD)結(jié)果顯示:與SHR-C組比較，兩GSPE干預(yù)組Ⅰ、Ⅲ膠原的表達均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);SHR-H組較SHR-L組兩種膠原表達

41、減少更明顯，組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢。
　　8.透射電鏡觀察3組腸系膜小動脈超微結(jié)構(gòu)的變化
　　電鏡下觀察到SHR-C組血管內(nèi)膜損傷嚴重，部分脫落，并有凋亡細胞出現(xiàn)，同時發(fā)現(xiàn)富含擴大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的AF遷移至中膜并出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化的特征:細胞膜下出現(xiàn)密斑，伴隨中膜和外膜中大量膠原蛋白不規(guī)則增生，分布紊亂，AF內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體“空泡化”改變;GSPE干預(yù)組腸系膜小動脈內(nèi)膜損傷減輕，膠原蛋白增生有所減輕，呈劑

42、量依賴性的改善，SHR-L組中膜可見遷移細胞，外膜中可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富的AF。
　　9.TUNEL法檢測凋亡細胞
　　TUNEL法檢測結(jié)果顯示:各組大鼠血管壁凋亡細胞細胞核染成棕黃色。與SHR-C相比，僅SHR-H組大鼠腸系膜小動脈組織凋亡細胞明顯減少，A0明顯下降（P＜0.01），與SHR-L組間亦有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），提示GSPE強大的抗凋亡能力及明顯劑量依賴性趨勢。
　　10.免疫組織化學(xué)法檢測增殖細胞核抗原

43、(PCNA)
　　PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示:增殖狀態(tài)的血管壁細胞核被染成棕黃色。與SHR-C組相比，僅SHR-H組大鼠腸系膜小動脈組織增殖細胞明顯減少，PI明顯下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　11.檢測4組大鼠腸系膜小動脈TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ的mRNA及蛋白表達
　　結(jié)果顯示:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠腸系膜小動脈膠原蛋白Ⅰ（P＜0.01）、膠原蛋白Ⅲ(P＜0.05)及TGF-β

44、1（P＜0.01）mRNA表達均明顯增加;而低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1mRNA表達下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4組大鼠血管壁膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1蛋白的表達差異與mRNA一致，即SHR-C組大鼠腸系膜小動脈膠原蛋白Ⅰ，膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1蛋白三種蛋白表達均高于WKT-C組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而

45、低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組膠原蛋白Ⅰ(P＜0.05)，膠原蛋白Ⅲ(SHR-L,P＜0.05.SHR-H, P＜0.01)、TGF-β1(SHR-L,P＜0.05; SHR-H, P＜0.01)蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。證實高血壓小動脈血管重構(gòu)與TGF-β1增強相關(guān)的膠原蛋白嚴重增生明顯相關(guān)，GSPE干預(yù)可明顯降低TGF-β1蛋白的表達，改善膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ增生，從而改善

46、小動脈血管重構(gòu)。
　　12.檢測4組大鼠腸系膜小動脈Bci-2和Bax mRNA及蛋白表達
　　結(jié)果顯示:與WKY-C組大鼠相比， SHR-C組大鼠腸系膜小動脈Bcl-2 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，BaxmRNA表達明顯增加（P＜0.05），Bcl-2與Bax的比值明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;而低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組Bcl-2mR

47、NA表達增加（SHR-L，P＜0.05;SHR-H，P＜0.01），SHR-H組Bax mRNA表達減少(P＜0.05)、低劑量組和高劑量組Bci-2與Bax mRNA表達的比值(SHR-L，P＜0.05; SHR-H，P＜0.01)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4組大鼠血管壁Bcl-2、Bax蛋白的表達差異與mRNA一致:與WKY-C組相比，SHR-C組Bcl-2的蛋白表達減少(P＜0.05)，Bax的表達增加不明顯，但Bcl-2/Bax蛋

48、白表達的比值降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組均可以提高Bcl-2蛋白的表達(P＜0.05)， SHR-H組可降低Bax蛋白的表達(P＜0.05)，兩組Bcl-2/Bax蛋白表達的比值也升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。證實高血壓小動脈血管重構(gòu)與高血壓誘導(dǎo)小動脈細胞凋亡增多相關(guān)，低劑量和高劑量GSPE可以通過明顯抑制細胞凋亡參與高血壓大鼠小動脈血管重構(gòu)。
　　結(jié)論：

49、　　1.氧化應(yīng)激水平增強與高血壓小血管膠原重構(gòu)密切相關(guān)，可能是其原因之一。
　　2.GSPE具有獨立于降壓作用之外的保護高血壓小血管重構(gòu)的作用，并呈劑量依賴性趨勢。
　　3.GSPE改善高血壓小動脈重構(gòu)的作用與抑制氧化應(yīng)激/TGF-β1信號通路有關(guān)，進而抑制AF激活、遷移、表型轉(zhuǎn)化，達到抑制小血管壁膠原蛋白過度合成、沉積。
　　4.GSPE還通過抑制氧化應(yīng)激減輕高血壓小動脈壁細胞凋亡，參與調(diào)節(jié)增殖/凋亡的平衡相關(guān)的小血