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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是臨床常見的急癥,國(guó)外報(bào)告其發(fā)病率10/105~44/105,近年來呈升高趨勢(shì)。約20%患者可發(fā)展為重癥急性胰腺炎,病死率高達(dá)15%~30%,病情危重,預(yù)后兇險(xiǎn),已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的重要?dú)⑹?。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)急性胰腺炎的防治進(jìn)行了多年的研究,但迄今還沒有針對(duì)急性胰腺炎特效的防治措施,其原因與目前對(duì)急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不夠深入有關(guān)。因此,深入研究
2、急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制,探索急性胰腺炎啟動(dòng)的關(guān)鍵過程,不僅具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值,而且將有助于尋找和建立有針對(duì)性的救治方法,以期提高急性胰腺炎的救治水平,具有重要的的意義。
自噬是廣泛存在于真核生物中的生命現(xiàn)象,屬程序性細(xì)胞死亡的一種。自噬發(fā)生時(shí),在細(xì)胞內(nèi)形成“雙層膜”結(jié)構(gòu)的囊泡即自噬體,包裹胞質(zhì)成分和某些細(xì)胞器碎片,送入溶酶體中并進(jìn)行多種酶的消化及降解,為細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)提供能量和小分子物質(zhì)。自噬是急性胰腺炎早期發(fā)生的事件,在急性
3、胰腺炎中的作用機(jī)制存在很多爭(zhēng)議。有學(xué)者采用敲除自噬相關(guān)基因小鼠研究后發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎減輕,同時(shí)自噬相關(guān)蛋白減少,推測(cè)自噬在急性胰腺炎中被誘導(dǎo)增強(qiáng),自噬對(duì)胰腺起損害作用;有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在急性胰腺炎中長(zhǎng)壽蛋白的降解大大減少(長(zhǎng)壽蛋白通過自噬途徑降解),大量空泡聚集,認(rèn)為自噬在急性胰腺炎中下降,自噬對(duì)胰腺起保護(hù)作用;另外有學(xué)者認(rèn)為自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,自噬過程在急性胰腺炎中被破壞,自噬和胰腺炎起相互促進(jìn)作用。這些相互矛盾結(jié)果顯示自噬在急性胰腺炎
4、發(fā)生中存在很大的爭(zhēng)議。
干擾素γ是一種來自T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液上清的蛋白,具有免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增殖作用。目前有研究發(fā)現(xiàn)干擾素γ可促進(jìn)自噬。另有文獻(xiàn)報(bào)告干擾素γ對(duì)急性胰腺炎有一定影響。為了進(jìn)一步探討自噬在急性胰腺炎發(fā)生過程中的變化及其病理意義,并觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎及自噬的影響,并探討其作用機(jī)制,擬開展本實(shí)驗(yàn)研究。
研究目標(biāo):
1.建立大鼠重癥急性胰腺炎模型。觀察急性胰腺炎發(fā)生過程中自噬活性的變化
5、,探討其病理意義。
2.觀察干擾素γ對(duì)急性胰腺炎炎癥及自噬的影響,初步探討其機(jī)制。
研究方法:
圍繞上述目標(biāo),本研究采用以下研究方法:
1.動(dòng)物模型的建立
采用左旋精氨酸400mg/100g(腹腔注射,2次,間隔1小時(shí))方法,構(gòu)建急性胰腺炎大鼠模型。
2.電鏡
大鼠新鮮胰腺組織取下后立即置于25%戊二醛電鏡固定液中,切成1mm3大小組織塊,
6、送電鏡室,于透射電鏡下觀察自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)。
3.ELISA
大鼠麻醉開腹后,心臟取血2~5ml置于抗凝管內(nèi),靜止2h后,3000rpm離心5min,取上清,置于-80℃冰箱低溫凍存待測(cè)。檢測(cè)時(shí)于4℃靜置解凍,用R&D試劑盒行ELISA檢測(cè),檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)AMY、TAP的濃度及IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平。
4.HE染色
標(biāo)本置于4%中性緩沖甲醛中固定24小時(shí),組織脫
7、水石蠟包埋,室溫保存,行HE染色后觀察胰腺炎癥程度。
5.免疫組化
經(jīng)漂洗,封閉,一抗和二抗孵育后檢測(cè)LC3、Beclin-1、Lamp-2等蛋白在胰腺組織中的表達(dá)。
6.Western Blot
經(jīng)過提取蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記一抗和二抗、曝光等步驟觀察LC3、Beclin-1、Lamp-2、GAPDH等蛋白的表達(dá)。
7.qRT-PCR
通過RNA提
8、取、逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的方法檢測(cè)胰腺組織LC3、Beclin-1、Lamp-2、Ⅲ型PI3K、GAPDH等蛋白的基因表達(dá)。
8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
全部數(shù)據(jù)通過SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,取P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±S)表示;兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),方差齊時(shí)采用LSD-t或SNK-q檢驗(yàn),方差不齊時(shí)
9、采用Dunnett's T3或Dunnett's C檢驗(yàn)。
研究結(jié)果:
1.20%L-精氨酸腹腔注射可構(gòu)建重癥急性胰腺炎模型
先后采用250mg/100g、300mg/100g、400mg/100g和500mg/100g等不同給藥劑量的20%L-精氨酸腹腔注射構(gòu)建重癥急性胰腺炎大鼠模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)400mg/100g的劑量腹腔注射2次,間隔1小時(shí)造模,可成功建立重癥急性胰腺炎大鼠模型。
10、 2.急性胰腺炎誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生
免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,大鼠急性胰腺炎模型組自噬相關(guān)因子LC3、Beclin-1的蛋白與mRNA表達(dá)顯著上調(diào);電鏡觀察發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎組大鼠胰腺組織自噬相關(guān)超微結(jié)構(gòu)明顯多于對(duì)照組。結(jié)果證實(shí)急性胰腺炎可誘導(dǎo)增強(qiáng)自噬的發(fā)生。
3.調(diào)控自噬可影響胰蛋白酶原的活化程度和急性胰腺炎的損傷程度
分別采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉
11、素(RAP)和自噬阻斷劑氯喹(CQ)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)調(diào)控自噬活性,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬后TAP明顯升高,阻斷自噬后TAP下降;SAP9h后誘導(dǎo)劑組大鼠胰腺壞死病理評(píng)分高于急性胰腺炎組,阻斷劑組與急性胰腺炎組無(wú)明顯差別,24h后誘導(dǎo)劑組胰腺壞死評(píng)分高于急性胰腺炎組,阻斷劑組胰腺壞死評(píng)分低于急性胰腺炎組。結(jié)果表明急性胰腺炎時(shí)自噬可促進(jìn)胰蛋白酶原的激活,并參與胰腺的損傷。
4.干擾素γ在急性胰腺炎時(shí)可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生及自噬體和
12、溶酶體的融合
與急性胰腺炎對(duì)照組相比,急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ,免疫組化、Western Blot和qRT-PCR檢測(cè)均表明自噬相關(guān)因子LC3及Beclin-1的蛋白和mRNA表達(dá)明顯上調(diào);溶酶體相關(guān)膜蛋白-2(Lamp-2)蛋白和基因表達(dá)亦明顯上調(diào)。結(jié)果表明干擾素γ可進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,并促進(jìn)自噬體和溶酶體的融合。
5.干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活和加重急性胰腺炎時(shí)胰腺的損傷
與急性
13、胰腺炎對(duì)照組相比,急性胰腺炎模型大鼠注射干擾素γ后胰腺水腫、炎癥、壞死、出血評(píng)分明顯增高;血漿炎癥因子IL-6濃度明顯升高,TAP在各時(shí)間點(diǎn)均明顯上升;淀粉酶峰值前移。結(jié)果表明干擾素γ能促進(jìn)胰蛋白酶原的激活,并加重急性胰腺炎時(shí)的炎癥反應(yīng)與胰腺損傷。
6.急性胰腺炎時(shí)干擾素γ可能通過Ⅲ型PDK通路來誘導(dǎo)自噬和加重炎癥
qRT-PCR顯示干擾素γ組Ⅲ型PI3K復(fù)合物(vps34) mRNA明顯高于急性胰腺炎對(duì)照組
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