通絡干預對高血壓病靶器官損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　論文Ⅰ通心絡對高血壓病心肌纖維化的作用及機制研究
　　目的:
　　1.觀察通心絡對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞表型轉化和功能異常的影響;
　　2.觀察通心絡對AngⅡ引起的心臟微血管內皮細胞損傷和活化的影響，以及對心臟細胞微環(huán)境的調節(jié);
　　3.探討通心絡發(fā)揮作用的具體機制，以及與miR-133a的關系。
　　方法：
　　1.原代心肌成纖維細胞和心臟微血管內皮

2、細胞分離、鑒定和培養(yǎng)
　　利用酶消化法和差速分離技術自Wistar乳鼠（出生1-3天內）的心臟分離原代心肌成纖維細胞和心臟微血管內皮細胞。分別利用成纖維特異性蛋白(FSP)-1抗體、乙?；兔芏戎?DiI-ac-LDL)抗體和CD31抗體進行細胞免疫熒光染色以鑒定心肌成纖維細胞和心臟微血管內皮細胞。取生長狀態(tài)良好的第2-3代細胞進行實驗。
　　2.篩選通心絡溶液對細胞活性作用的合適濃度區(qū)間和時間
　　采用CCK-8方

3、法進行細胞活性檢測，以分別篩選通心絡溶液對心肌成纖維細胞和心臟微血管內皮細胞作用的合適濃度區(qū)間和時間。
　　3.心肌成纖維細胞的分組與干預
　　(1)觀察通心絡對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞轉化的影響以及其篩選最佳作用濃度:分為空白對照組(control組)、陽性對照組(AngⅡ組)、各實驗組(AngⅡ+不同濃度通心絡溶液）。按分組僅給予培養(yǎng)基或給予培養(yǎng)基、通心絡溶液和/或AngⅡ100 nM刺激24小時。提取蛋白，檢測α-

4、SMA蛋白表達，觀察通心絡對心肌成纖維細胞的表型轉化的影響。(2)根據(jù)干預因素分組:分為空白對照組(control組)、陽性對照組(AngⅡ組)、陰性對照組(negative control組，AngⅡ+ScrambledsiRNA轉染+通心絡)和實驗組(treat組，AngⅡ+miR-133a inhibitors轉染+通心絡)。
　　結果：
　　1.通心絡抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞的表型轉化
　　(1)通心

5、絡作用于心肌成纖維細胞的適宜濃度范圍和時間的篩選
　　濃度在400μg/mL以內的通心絡溶液是實驗的適宜濃度范圍;24h對細胞活力影響最小。
　　(2)通心絡抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞的α-SMA蛋白的表達。
　　與空白對照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞α-SMA的表達水平而不同濃度的通心絡均顯著抑制了AngⅡ誘導心肌成纖維細胞的α-SMA表達;通心絡在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的抑制作用，該

6、濃度作為心肌成纖維細胞后續(xù)實驗的適宜濃度。
　　(3)通心絡抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞的功能活化。
　　與空白對照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞3H-羥脯氨酸摻入量;通心絡顯著抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞3H-羥脯氨酸摻入量。
　　與空白對照組比較，AngⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原和IL-6的分泌;通心絡顯著抑制了AngⅡ誘導的Ⅰ型膠原和IL-6的分泌。
　　與空白對照組比較，An

7、gⅡ顯著增加了心肌成纖維細胞遷移能力;通心絡顯著抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞遷移能力。
　　2.通心絡改善了AngⅡ誘導的心臟微血管內皮細胞的損傷和活化
　　(1)通心絡作用于心臟微血管內皮細胞的適宜濃度范圍和時間的篩選
　　使用濃度在400μg/mL以內的通心絡溶液是實驗的適宜濃度范圍。同時，結果顯示400μg/mL的通心絡在24h內對細胞活性無顯著影響。
　　(2)通心絡改善了AngⅡ損傷的心臟微血管內

8、皮細胞的體外成管功能
　　與空白對照組比較，AngⅡ顯著抑制了心臟微血管內皮細胞的體外成管功能。不同濃度的通心絡均顯著改善了心臟微血管內皮細胞的成管功能;通心絡在400μg/mL的濃度時產(chǎn)生了最大的作用。
　　(3)通心絡對AngⅡ作用下的心臟微血管內皮細胞NO含量以及CTGF和IL-6分泌的影響
　　空白對照組比較，AngⅡ顯著減少心臟微血管內皮細胞的NO含量并增加了CTGF和IL-6分泌量;而通心絡干預顯著增加了N

9、O含量并減少了CTGF和IL-6分泌量。
　　結論：
　　1.通心絡抑制了AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞表型轉化和功能活化，其作用與促進miR-133a表達、抑制促纖維生成相關的信號通路Smad3/CTGF有關;
　　2.通心絡保護了AngⅡ損傷的心臟微血管內皮細胞的功能狀態(tài)，其作用與促進miR-133a表達、抑制caveolin-1表達、活化血管內皮保護相關的信號通路eNOS/NO有關;
　　3.通心絡抑制了心臟

10、微血管內皮細胞的活化，改善了其異常代謝與分泌功能，從而調節(jié)了促心肌成纖維細胞活化和促纖維形成的細胞微環(huán)境。
　　論文Ⅱ 通心絡對高血壓病心肌纖維化的作用及機制研究（動物實驗）
　　目的:
　　1.觀察通心絡對自發(fā)性高血壓大鼠的心肌纖維化和與促纖維生成的心臟微環(huán)境（微血管生成和炎癥反應）的影響;
　　2.探討通心絡在自發(fā)性高血壓大鼠體內作用機制，及與miR-133a的關系。
　　方法：
　　1.實驗動物

11、的分組
　　將40只8周齡雄性SHR隨機分為通心絡不同劑量治療組即高劑量治療組、中劑量治療組和低劑量治療組，以及陽性對照組，每組各10只。10只8周齡雄性Wistar大鼠作為正常對照組。
　　2.血壓和心功能的測量
　　采用無創(chuàng)血壓計測量大鼠尾動脈壓;采用二維、M超、組織多普勒和脈沖多普勒超聲成像技術評價大鼠左室舒張和收縮功能。
　　3.組織病理學分析
　　將大鼠心臟標本制備為石蠟切片，進行心肌膠原的Mas

12、son染色，并計算膠原膠原容積分數(shù)。應用免疫組織化學染色，觀察心臟組織CD31的表達并計算心臟微血管密度。
　　結果：
　　1.通心絡降低了SHR的收縮壓
　　SHR組及通心絡不同劑量組血壓顯著高于WKY組;與SHR比較，通心絡治療顯著抑制了SHR血壓升高的趨勢。各不同劑量治療組間沒有顯著性差異。
　　2.通心絡改善了SHR心臟舒張功能
　　SHR組及通心絡不同劑量組的左室舒張功能E/A值、左室壁動度E'/

13、A'值顯著低于WKY組。與SHR組比較，通心絡不同劑量組的E/A值、E'/A'值顯著升高。但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　與WKY組比較，SHR組及通心絡不同劑量組的EF及FS值無顯著差異。
　　3.通心絡減輕了SHR心肌纖維化程度
　　SHR組及通心絡不同劑量組的膠原容積分數(shù)明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡不同劑量組的CVR顯著降低;但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　SHR組及通心絡不同劑量組的Col

14、I的表達明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡不同劑量組的ColI的表達顯著降低;但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　SHR組及通心絡不同劑量組的α-SMA的表達明顯高于WKY組。與SHR組比較，通心絡不同劑量組的α-SMA的表達顯著降低(p＜0.05);但各劑量組間并沒有顯著差異。
　　結論：
　　1.通心絡可以改善高血壓病心肌纖維化，以及通過增加心臟微血管密度和減輕心臟炎癥水平，糾正了促纖維生成的心臟微環(huán)境改變，從

15、而較好的改善了心臟的功能和結構重塑;
　　2.在體外實驗的基礎上，動物實驗證實了通心絡可以調節(jié)SHR心臟miR-133a的表達水平，并影響miR-133a調控的下游靶基因相關的促纖維化和促血管生成相關的信號通路;
　　3.以通心絡為代表的通絡干預適用于心肌纖維化的治療。
　　論文Ⅲ 通心絡對高血壓病腎損害的作用及機制研究
　　目的：
　　1.觀察通心絡對SHR高血壓病腎損傷在結構和功能的影響;
　　2

16、.探討通心絡對SHR腎臟氧化應激與抗氧化機制的影響;
　　3.探討通心絡對SHR高血壓病腎損傷的可能的作用機制，及其與FoxO1信號通路及其轉錄后調節(jié)機制的關系。
　　方法：
　　1.實驗動物的分組
　　自發(fā)性高血壓大鼠作為原發(fā)性高血壓的動物模型。將20只8周齡雄性SHR隨機分為通心絡治療組，以及陽性對照組，每組各10只。10只8周齡WistarKyoto大鼠作為正常對照組。通心絡溶于生理鹽水配成溶液，通心絡治療

17、組每天分別按每千克體重給予SHR0.38g通心絡溶液灌胃。正常對照組(WKY組)和陽性對照組(SHR組)每天給予等量生理鹽水灌胃。
　　2.血壓的測量
　　采用無創(chuàng)血壓計測量大鼠尾動脈壓。
　　3.腎功能參數(shù)的測量
　　采用ELISA法分析尿蛋白、血清和尿肌酐，并計算尿蛋白排泌率和肌酐清除率。
　　結果：
　　1.通心絡降低了SHR的血壓。
　　與對照組比較，通心絡治療組的收縮壓顯著下降。

18、>　　2.通心絡減輕了SHR的腎功能損傷。
　　與對照組比較，通心絡治療組的尿蛋白排泌率和肌酐清除率顯著下降。
　　3.通心絡減輕了SHR腎臟氧化應激損傷。
　　與對照組比較，通心絡治療組的腎臟MDA、蛋白質羰基、NOX活性及亞單位mRNA表達顯著減少。
　　結論：
　　1.通心絡改善了高血壓病腎臟結構和功能的損害;
　　2.通心絡減輕了高血壓病腎臟氧化應激損傷和炎癥，改善了腎臟的抗氧化能力;