華南地區(qū)肉芽腫性小葉性乳腺炎的細(xì)菌學(xué)研究.pdf

1、肉芽腫性小葉性乳腺炎（granulomatous lobular mastitis，GLM），是一種發(fā)生于乳腺小葉、以肉芽腫形成為主要特征的乳腺慢性炎性疾病。通常表現(xiàn)為乳房腫物，伴有疼痛，皮膚呈現(xiàn)出紅腫、潰瘍、竇道等急慢性炎癥反應(yīng)，影像學(xué)和臨床上很容易與乳腺癌，特別是炎性乳腺癌相混淆。因此，對(duì)GLM的鑒別診斷和對(duì)癥治療是預(yù)防與治療乳腺疾病的一個(gè)難題。目前對(duì)GLM的病理表現(xiàn)和疾病的發(fā)展進(jìn)程認(rèn)識(shí)不足，對(duì)該病的病因和發(fā)病機(jī)制也缺乏深入了解，導(dǎo)

2、致臨床上對(duì)GLM的治療帶來盲目性，誤診誤治的病歷并不少見，對(duì)患者的身體與身心健康帶來嚴(yán)重的影響。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)華南地區(qū)GLM患者的膿液標(biāo)本和組織標(biāo)本為研究對(duì)象，試圖找出引起該地區(qū)GLM的潛在致病菌，并且對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析，并結(jié)合文獻(xiàn)分析不同地區(qū)GLM的致病菌的異同。利用細(xì)菌培養(yǎng)、革蘭氏染色和細(xì)菌16S rDNA序列測(cè)定的技術(shù)鑒定華南地區(qū)GLM的潛在致病細(xì)菌，通過系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，構(gòu)建細(xì)菌特定的系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定細(xì)菌的分類地位。本實(shí)驗(yàn)有望

3、為GLM的病因和發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：選擇2014年6月至2016年6月于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺科門診就診及住院的華南地區(qū)肉芽腫性小葉性乳腺炎患者，在手術(shù)室無(wú)菌條件下取得的32份標(biāo)本，其中膿液標(biāo)本14例，組織標(biāo)本18例。
　　將收集到的14例膿液標(biāo)本分別接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，在37℃恒溫，5％CO2培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h以上。若培養(yǎng)呈陽(yáng)性，則進(jìn)行革蘭氏染色。將培養(yǎng)呈陽(yáng)性的細(xì)菌和收集到的18例GLM患者的

4、組織標(biāo)本進(jìn)行總DNA的提取，采用細(xì)菌特異性的引物，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，克隆建庫(kù)后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果跟NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定細(xì)菌的分類地位。
　　結(jié)果：對(duì)華南地區(qū)14例GLM患者的膿液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，兩天后發(fā)現(xiàn)只有4例標(biāo)本能夠在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落，膿液的細(xì)菌檢出率為28.57%。長(zhǎng)出的菌落細(xì)小光滑，將細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察到細(xì)菌呈桿狀，且呈紫色，可初步判定為革

5、蘭氏陽(yáng)性桿菌。將測(cè)序得到的細(xì)菌16S rDNA序列與 NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，其中兩例與數(shù)據(jù)庫(kù)上C.kroppenstedtii的相似度達(dá)到99.9%；另外兩例分別與數(shù)據(jù)庫(kù)上M.abscessus和P.avidum的相似度也高達(dá)100%。采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）計(jì)算及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從分子系統(tǒng)發(fā)育水平上支持了這四例細(xì)菌的分類地位。
　　對(duì)華南地區(qū)18例GLM患者的組織標(biāo)本進(jìn)行 HE染

6、色，發(fā)現(xiàn)GLM周圍有乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張癥，導(dǎo)管內(nèi)有炎性滲出物與分泌物，周圍可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。分別提取18例GLM組織標(biāo)本的總DNA，全部提取成功，然而只有兩例標(biāo)本能夠成功PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行克隆建庫(kù)，測(cè)序。將測(cè)序得到的細(xì)菌16S rDNA序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中的一例與國(guó)際基因數(shù)據(jù)庫(kù)上T.aquatica的相似度達(dá)到99.9%；另一例與數(shù)據(jù)庫(kù)上C.amycolatum的相似度

7、也為99.9%。應(yīng)用DNAClub、MEGA軟件進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子系統(tǒng)發(fā)育水平上支持了這兩例細(xì)菌的分類地位。
　　結(jié)論：基于本實(shí)驗(yàn)研究的華南地區(qū)32例GLM標(biāo)本，初步確定該地區(qū)GLM與細(xì)菌C.kroppenstedtii、M.abscessus、P.avidum、C.amycolatum和T.aquatic具有相關(guān)性。通過細(xì)菌培養(yǎng)和不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法能夠?qū)θA南地區(qū)GLM相關(guān)的細(xì)菌進(jìn)行