通過調控Smad3誘導自噬減輕膿毒癥肺損傷作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　膿毒癥是臨床最常見的嚴重創(chuàng)傷、燒傷以及大手術后之的并發(fā)癥，短時間內可發(fā)展成為多器官功能障礙綜合征，是當前創(chuàng)傷、燒傷和外科危重病人死亡的最主要原因。其中膿毒癥相關急性肺損傷不但出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高，而且進展迅速，病死率可高達70％～90％，目前并無有效治療手段。
　　我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)膿毒癥背景下Smad3可以降低重要臟器對LPS的敏感性。同時研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路與自噬密切相關，而自噬是廣泛存

2、在于真核細胞的生命現(xiàn)象，具有吞噬病原體、調解炎癥反應、減輕細胞凋亡等作用。因此我們認為Smad3對膿毒癥的保護機制和自噬反應密切相關。
　　另外，Smad3的表達與活化還能夠受到轉錄后水平的調節(jié)，這一類的調節(jié)因素主要是由非編碼RNA包括microRNA介導的，而外泌體作為人體內一類重要囊泡，其中包含的主要是非編碼RNA（miroRNA，LncRNA等）。研究發(fā)現(xiàn)細胞會通過分泌外泌體囊泡將信號分子傳遞到較遠的組織或細胞中發(fā)揮調控作用

3、。但是在膿毒癥的微環(huán)境中，肺組織細胞釋放的外泌體中是否包含影響Smad3表達與活化的microRNAs，并且進一步影響到膿毒癥患者預后的研究，目前尚未見報道。
　　鑒于Smad3在膿毒癥中發(fā)揮保護作用，利用現(xiàn)有藥物樣本庫篩選針對Smad3本身活化的臨床藥物亦是防治膿毒癥的策略之一。在未獲得Smad3擬效劑的情況下，以膿毒癥致病機制的關鍵信號通路——LPS-TLR4通路著手展開針對膿毒癥防治的研究。
　　綜上所述，我們利用Sm

4、ad3基因缺陷小鼠探討Smad3在膿毒癥肺損傷中和自噬的關系，同時通過利用臨床膿毒癥患者血清標本，查找靶向調控Smad3的外泌體miRNAs，最后通過篩選通路抑制劑藥物來綜合探討膿毒癥防治新策略。
　　第一部分 Smad3調控自噬減輕膿毒癥肺損傷的作用研究
　　研究目的:通過建立體內外Smad3(-/-)小鼠膿毒癥肺損傷模型，觀察smad3敲除后自噬相關基因表達的變化。
　　研究方法:體內實驗通過氣道滴入LPS構建膿毒

5、癥急性肺損傷模型，體外實驗通過慢病毒包裝構建穩(wěn)定干擾Smad3的BEAS-2B細胞系，然后LPS刺激建立體外模型，通過電鏡、HE染色、免疫組化以及ELISA，qPCR、蛋白免疫印跡法等分子生物學方法觀察炎癥損傷情況以及檢測自噬相關基因的表達變化。
　　研究結果:1.Smad3基因敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重，肺干濕重比增加（*p＜0.05）;HE染色KO組肺泡塌陷更多，出血明顯，中性粒細胞浸潤較WT組更多;ELISA檢測小鼠血清和肺

6、泡盥洗液TNF-a和IL-6的表達明顯高于WT對照組(*p＜0.05)。
　　2.損傷早期(6h)電鏡下KO組自噬小體形成明顯增加，但自噬蛋白LC3 mRNA水平表達下降（*p＜0.05），蛋白水平卻表達增加;
　　3.成功構建si-Smad3 BEAS-2B細胞系，發(fā)現(xiàn)6h時自噬蛋白LC3B LPS-shSmad3組較LPS-NC組表達明顯上調。
　　結論:Smad3敲除后小鼠膿毒癥肺損傷加重，自噬增加。Smad3可

7、能通過調控自噬來降低肺對LPS的易感性。
　　第二部分外泌體miRNAs調控Smad3減輕膿毒癥肺損傷
　　研究目的:利用小RNA高通量測序和基因芯片技術檢測動物和患者血清外泌體，篩選出靶向調控Smad3的miRNAs，并驗證其調控自噬的機制。
　　研究方法:以Smad3（-/-）小鼠構建氣道滴入LPS膿毒癥急性肺損傷模型，收集小鼠肺組織一部分通過WB檢測Smad3活化情況，一部分進行高通量測序，提取血清和肺泡盥洗液外

8、泌體進行基因芯片檢測，再結合臨床膿毒癥患者不同時期的血清外泌體進行小RNA高通量測序，通過組間差異分析以及聚類分析等生物信息學手段篩選受Smad3調控的下游miRNAs和靶向調控Smad3的上游miRNAs，最后用BEAS-2B細胞系體外實驗進行驗證目的miRNA是否調控自噬。
　　研究結果:1.膿毒癥小鼠急性肺損傷6h之后，Smad3磷酸化表達顯著升高。
　　2.肺組織測序發(fā)現(xiàn)Smad3敲除之后，miR-574-5p表達減

9、少，而血清和肺泡盥洗液外泌體基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)KO/WT表達增高的有miR-1196-5p，miR-574-5p，但miR-1196在肺組織測序中沒有檢測到。
　　3.在LPS刺激下，miR-574-5p模擬物外源性刺激BEAS-2B細胞系，自噬表達上調;而用miR-574-5p抑制劑可以抑制自噬的表達。
　　4.膿毒癥患者血清外泌體小RNA測序后組間差異分析發(fā)現(xiàn)對照組和燒傷后10天患者的血清外泌體miRNA相比，有顯著差異p

10、＜0.01的共有69個;和燒傷后20天的患者血清外泌體miRNA比較，兩組有顯著差異p＜0.01的共有74個;和燒傷后30天組相比，兩組有顯著差異p＜0.01的共有42個。
　　5.時間序列分析篩選出差異表達下降的miRNAs，再進行靶基因預測發(fā)現(xiàn)和 smad3，LC3B同時相關的一共有5個，分別是miR-9-5p,miR-3135b,miR-432-5p,miR-409-3p,miR-744-5p。經(jīng)體外細胞系RAW264.7膿

11、毒癥模型驗證其表達量，發(fā)現(xiàn)變化趨勢和臨床膿毒癥患者血清基本一致。
　　結論:1.小鼠膿毒癥肺損傷早期Smad3缺失導致自噬上調，其機制可能與肺上皮細胞分泌miR-574誘導自噬發(fā)生有關。
　　2.smad3基因在臨床膿毒癥患者中發(fā)揮的保護作用可能與上游靶向調控它，的miRNAs下降有關。
　　第三部分 LPS-TLR4信號通路抑制劑DMF防治膿毒癥機制
　　研究目的:分子層面探索DMF抑制LPS-TLR4信號活化

12、的機制并驗證其對膿毒癥的防治作用。
　　研究方法:從臨床藥物庫篩選LPS-TLR4通路抑制劑DMF，利用LPS刺激RAW264.7細胞，設不同的DMF濃度梯度組，采用免疫蛋白印跡檢測NFkB信號通路中4個關鍵蛋白的活化情況。最后以LPS腹腔注射構建膿毒癥模型，通過動物生存率實驗觀察其對膿毒癥的防治效果。
　　研究結果:1.RAW細胞經(jīng)LPS刺激后DMF干預組，NO濃度依次降低，iNOS表達受到抑制;同時DMF抑制LPS-TL

13、R4通路下游IKK，IkB，NFkB磷酸化表達，而IRAK蛋白表達沒有變化。
　　2.生存率時間效應梯度實驗發(fā)現(xiàn)只有術前給藥36h和48h能達到50％的生存率，（*p＜0.05），生存率劑量效應梯度實驗證實DMF30mg/Kg可以提高小鼠膿毒癥生存率50％，15mg/Kg可以提升25％（*p＜0.05）。
　　3.體內外實驗證明DMF可以有效抑制炎癥因子TNF-a，IL-6，IL-10的表達（*P＜0.05），另外HE染色顯