RIPK2介導自噬對高糖誘導的小鼠腎小球系膜細胞ROS-NLRP3炎癥小體信號的調(diào)控研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病（Diabetic nephropathy,DN）是一種糖尿?。―iabetes mellitus,DM）主要而嚴重的微血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制錯綜復雜，其發(fā)生發(fā)展涉及多個因素參與，近年來不少研究表明，氧化應激及免疫炎癥反應可能參與糖尿病腎損害的不同病理過程并發(fā)揮核心作用。我們的前期研究表明，高糖可誘導氧化應激，激活活性氧（Reactive oxygen species, ROS）及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（Nu

2、cleotide binding and oligomerizationdomain-like receptor family pyrin domain-containing3,NLRP3）炎癥小體信號通路，誘導活半胱氨酸蛋白酶1（Cysteine-aspartic acid protease1,Caspase1）及促炎細胞因子白細胞介素1-β（Interleukine-1 beta,IL-1β）的成熟與分泌。自噬（Autophagy）

3、是一種清除損傷蛋白質(zhì)或細胞器以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的降解過程，通過清除損傷線粒體減少ROS產(chǎn)生而實現(xiàn)能量回收，可能參與調(diào)節(jié)ROS及下游的NLRP3炎癥小體信號通路，避免過度的免疫炎癥反應。然而到目前為止，高糖刺激下腎系膜細胞（Glomerular mesangial cell, GMC）的自噬水平及調(diào)節(jié)機制研究尚少，且研究結果存在爭議，既往研究表明，適當增強自噬可能減少氧化應激及免疫炎癥反應，但過度自噬可能引起自噬性細胞損傷，加重細胞凋亡。在

4、有限的自噬調(diào)節(jié)機制研究中，受體結合絲氨酸/蘇氨酸激酶2（Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase2,RIPK2），一種Nod樣受體（Nod-like receptor, NLR）家族中Nod1/Nod2的重要連接蛋白，被證明既可激活核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）及絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kina

5、ses,MAPKs）介導的炎癥反應,還參與Nod1/Nod2介導的自噬反應，提示RIPK2可能參與調(diào)節(jié)自噬及ROS-NLRP3炎癥小體信號通路，但目前尚缺乏研究探討高糖刺激腎系膜細胞對RIPK2以及RIPK2與自噬、ROS-NLRP3炎癥小體信號通路的影響，因此本研究通過觀察小鼠腎系膜細胞中RIPK2、LC3II/I、ROS、Caspase1、IL-1β在不同時間及不同濃度高糖干預下的表達變化，同時檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β表達，再

6、通過細胞轉(zhuǎn)染RIPK2-siRNA干擾RIPK2后再次觀察自噬水平及ROS-NLRP3炎癥小體關鍵因子的改變，旨在探討高糖對腎系膜細胞RIPK2、自噬的影響以及自噬對ROS-NLRP3炎癥小體信號通路的調(diào)控作用，為DN的防治提供新的思路。
　　方法：
　?。?）細胞培養(yǎng)及分組：體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞（SV40），以高糖作為刺激因素，分為以下三組：①正常對照組(Normal control group,NC組)：培養(yǎng)基含5

7、.6mmol/L葡萄糖；②滲透壓對照組(Osmotic pressure group, OP組)：培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇。③不同高糖濃度干預組(High glucose group, HG組)：培養(yǎng)基分別含10mmol/L葡萄糖（HG1組）、20mmol/L葡萄糖（HG2組）、30mmol/L葡萄糖（HG3組）；
　?。?）各組細胞培養(yǎng)0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后，用W

8、estern-blot檢測RIPK2、LC3II/I、Caspase1、IL-1β的蛋白表達；RT-PCR檢測RIPK2、Caspase1、IL-1βmRNA表達；mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒標記LC3以觀察自噬流；各組細胞適時隨機加入處理因素后裝載2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽探針(2’,7’-Dichlorofluorescin Diacetate,DCFH—DA)，并用分光光度計檢測細胞內(nèi)ROS水平變化；ELISA檢測

9、培養(yǎng)上清液IL-1β濃度。
　?。?）RIPK2的siRNA干擾研究：篩選出最佳高糖作用濃度（30mmol/L）和時間（12h）后，細胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA，再次進行分組：①siNC組：細胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；②siRIPK2組：細胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA加入含5.6mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；③HG+siNC組：細胞轉(zhuǎn)染control siRNA加入含3

10、0mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；④HG+siRIPK2組細胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA加入含30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)12h；再次采用Western-blot、RT-PCR、 mRFP-GFP-LC3標記+共聚焦顯微鏡、DCFH—DA標記+分光光度計及ELISA等方法檢測上述指標。
　?。?）統(tǒng)計學分析：采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分

11、析對多組間均數(shù)進行比較，組間多重比較用LSD—t法。我們定義P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　?。?）與NC組相比，高糖刺激可增加細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表達，差異均具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，且具有時間及濃度依賴性。
　?。?）與NC組相比，高糖在短期作用時間內(nèi)（0-12h）可誘導RIPK2、LC3II/I蛋白及RIPK2mRNA表達(P<0.05)，且在3

12、0 mmol/L高糖作用12h條件下表達顯著增強，超過12h作用時間后RIPK2及LC3II/I表達下調(diào)(P<0.05)。
　?。?）細胞轉(zhuǎn)染RIPK2 siRNA后成功抑制RIPK2表達。與siNC組相比， siRIPK2組LC3II/I表達顯著下調(diào)，而細胞內(nèi)ROS產(chǎn)量、Caspase1及IL-1β蛋白表達則顯著增加(P<0.05)。
　　結論：
　?。?）高糖可激活小鼠腎系膜細胞ROS-NLRP3炎癥小體信號通路。