轉(zhuǎn)基因棉花MON531R7569中截短cry1Ac基因表達的初步分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是目前我國種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。美國孟山都公司研發(fā)的一代抗蟲棉MON531轉(zhuǎn)化體已在我國批準商業(yè)化種植和應用超過20年。MON531R7569是本實驗室發(fā)現(xiàn)的與MON531轉(zhuǎn)化體具有相同旁側(cè)序列但cry1Ac基因發(fā)生截短的轉(zhuǎn)基因棉花材料。本研究驗證了MON531R7569的分子結(jié)構(gòu)，建立了其檢測方法，分析了截短cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平，初步分析了cry1Ac基因的甲基化情況，主要結(jié)果有以下五個方面.
　

2、　1.采用PCR方法驗證了MON531R7569的外源整合結(jié)構(gòu)，并建立了MON531R7569的特異性定量PCR檢測方法。結(jié)果表明:MON531R7569的轉(zhuǎn)基因整合結(jié)構(gòu)與MON531整合結(jié)構(gòu)相同，但cry1Ac基因3'端序列及終止子區(qū)域發(fā)生缺失。基于cry1Ac基因重組區(qū)域建立了定量檢測方法，對476份市場轉(zhuǎn)基因棉花的定量分析表明有4份樣品檢出MON531R7569，含量最高為1.56％。
　　2.利用RACE和RT-PCR方法

3、分析了MON531R7569的cry1Ac基因轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)錄本分析表明MON531R7569的cry1Ac基因轉(zhuǎn)錄終止位點主要集中在截短位置下游161-173和233-265堿基處。轉(zhuǎn)錄水平分析表明MON531R7569和MON531的葉片中cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄水平隨苗期、蕾期、鈴期逐漸下降，MON531R7569苗期和蕾期葉片中的cry1Ac基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于MON531，但鈴期葉片中無顯著差異。
　　3.采用EL

4、ISA方法測定了MON531R7569中Cry1Ac蛋白表達量。結(jié)果表明葉片中Cry1Ac蛋白表達量隨苗期、蕾期、鈴期逐漸下降，三個時期的Cry1Ac蛋白表達量均高于MON531。
　　4.采用離體葉片法測定了對MON531R7569苗期葉片對棉鈴蟲的抗性。結(jié)果表明MON531R7569轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對棉鈴蟲幼蟲的校正死亡率為99.47％，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531R7569的抗性水平為高抗;MON531轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對棉鈴蟲的校正死亡

5、率為95.21％，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531的抗性水平為高抗。
　　5.采用甲基化敏感內(nèi)切酶定量PCR方法(MSRE-qPCR)和亞硫酸鹽測序法(BS-seq)，分析了MON531R7569和MON531中cry1Ac基因表達框序列的甲基化水平。結(jié)果顯示全部13個HpyCH4IV位點中MON531R7569有3個位點甲基化水平高，位于截短cry1Ac基因閱讀框之外。而MON531有5個位點甲基化水平高，位于cry1Ac基因的3'端區(qū)