異丙酚對(duì)鼠發(fā)育中大腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖與凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、每年全世界有成千上萬(wàn)的嬰幼兒接受外科手術(shù)、有創(chuàng)性治療或一些需要麻醉輔助的影像學(xué)檢查,這些嬰幼兒需要接受各種麻醉藥和鎮(zhèn)靜藥的輔助治療,因此,研究麻醉藥對(duì)發(fā)育中大腦的影響具有重要的臨床意義。研究顯示臨床上使用麻醉藥對(duì)發(fā)育中的哺乳動(dòng)物大腦有潛在危害,在大腦快速發(fā)育期,也就是突觸形成期,給予麻醉藥會(huì)引起哺乳動(dòng)物大腦敏感區(qū)域神經(jīng)凋亡,尤其是在出生后第七天鼠,對(duì)麻醉藥的凋亡作用非常敏感。越來(lái)越多數(shù)據(jù)表明麻醉藥包括異氟醚、氯胺酮、NO、咪唑安定、硫噴

2、妥納、異丙酚、七氟醚對(duì)發(fā)育中大腦有毒性作用并且能引起長(zhǎng)時(shí)期認(rèn)知功能障礙。神經(jīng)毒性的嚴(yán)重程度與劑量和暴露的時(shí)間有關(guān),并且復(fù)合麻醉后加重,其機(jī)制涉及GABA、甘氨酸、谷氨酸、尼古丁等多個(gè)受體和相關(guān)的通路,但是其具體的分子機(jī)制并未明確。
　　 異丙酚(Propofol)是一種新型的短效靜脈麻醉藥物,80年代中期開(kāi)始應(yīng)用于臨床。1989年美國(guó)FDA通過(guò)并推薦臨床使用,目前被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床麻醉誘導(dǎo)、維持及ICU鎮(zhèn)靜。隨著臨床的廣泛應(yīng)

3、用,人們發(fā)現(xiàn)異丙酚有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):起效快,麻醉狀態(tài)可控性強(qiáng),維持時(shí)間短,蘇醒迅速,無(wú)積蓄,副作用小等,在產(chǎn)科和兒科手術(shù)也逐漸被推廣使用,目前臨床上輸注異丙酚是否會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶障礙或者發(fā)育延遲還沒(méi)有報(bào)道,但已經(jīng)有動(dòng)物研究表明異丙酚對(duì)發(fā)育中大腦神經(jīng)有促凋亡作用,長(zhǎng)時(shí)間使用異丙酚會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加,并且成年后學(xué)習(xí)能力缺失,然而異丙酚引起神經(jīng)凋亡與神經(jīng)功能損害的機(jī)制目前還不清楚。
　　 為了探索異丙酚引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制,有學(xué)

4、者研究了異丙酚及GABA-A調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子及海馬神經(jīng)細(xì)胞早期及延遲細(xì)胞死亡的影響。研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)出生后第四天海馬神經(jīng)細(xì)胞暴露于5umol/L異丙酚5個(gè)小時(shí)引起細(xì)胞去極化,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,Caspase激活,促進(jìn)細(xì)胞死亡,使用GABA-A受體阻斷劑荷包牡丹堿或者鈣通道阻斷劑引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低,抑制細(xì)胞死亡,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是細(xì)胞凋亡的必要條件,但使用GABA-A激動(dòng)劑蠅蕈醇雖然引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,但沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)

5、胞死亡,因此鈣離子濃度升高不能完全解釋異丙酚引起的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)內(nèi)源性或者外源性途徑。內(nèi)源性途徑通過(guò)下調(diào)抗凋亡bcl-2蛋白家族,比如bcl-xL,增加細(xì)胞線粒體通透性,使細(xì)胞色素C釋放,激活caspase-9和caspase-3,導(dǎo)致凋亡損害。外源性通路由死亡受體激活,形成死亡受體復(fù)合物,包含F(xiàn)as、TNF-α超家族,死亡受體復(fù)合物激活caspase-8,最后激活caspase-3,誘導(dǎo)凋亡,那么異丙酚引起細(xì)胞凋亡的原因是

6、什么,它是通過(guò)何種凋亡途徑引起的,基于此,我們體外培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞,用Brdu法觀察了異丙酚對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響,采用細(xì)胞流式技術(shù)觀察了不同濃度異丙酚對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,同時(shí)提取蛋白通過(guò)westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路上的幾個(gè)關(guān)鍵蛋白細(xì)胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9,從而探討異丙酚引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路,為尋找相應(yīng)的靶點(diǎn),阻斷細(xì)胞凋亡通路,減輕異丙酚神經(jīng)毒性作用打下基礎(chǔ)。
　　

7、 已經(jīng)有研究表明干預(yù)GABA受體和NMDA受體可以引起神經(jīng)增殖改變,而麻醉藥的作用受體主要為GABA受體和NMDA受體。因此,麻醉藥對(duì)發(fā)育中大腦毒性反應(yīng)除引起凋亡外,也可能對(duì)神經(jīng)增殖產(chǎn)生影響。Stratmann等證實(shí)7日齡使用3.5％異氟醚,發(fā)現(xiàn)齒狀回神經(jīng)增殖減少至少持續(xù)4天以上,并導(dǎo)致永久的神經(jīng)功能損害,而這種現(xiàn)象并沒(méi)有在出生60天幼鼠發(fā)生。異丙酚作為臨床上常用的靜脈全麻藥,除了對(duì)發(fā)育中大腦神經(jīng)有促凋亡作用,那么對(duì)于發(fā)育中大腦神經(jīng)增殖

8、有沒(méi)影響呢?近來(lái),許多學(xué)者對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞及其子代細(xì)胞生成早期(前4周)的神經(jīng)元電生理特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)前體細(xì)胞在早期尚未具備自發(fā)性或者誘發(fā)突觸后電位之前即被GABA激動(dòng),并可進(jìn)一步激活局部神經(jīng)元之間的GABA電流。在前體細(xì)胞分化為粒狀神經(jīng)元后,新生細(xì)胞開(kāi)始接受突觸GABA內(nèi)向電流,一周后開(kāi)始接受谷氨酸內(nèi)向電流。Ge等采用shRNA下調(diào)新生神經(jīng)元的Na+-K+-2CL-轉(zhuǎn)運(yùn)體,發(fā)現(xiàn)GABA介導(dǎo)的突觸聯(lián)系的形成,并且會(huì)損害新生神經(jīng)

9、元樹(shù)突的發(fā)育,提示GABA介導(dǎo)的去極化對(duì)于新生神經(jīng)元的成熟和功能具有重要的作用。在突觸形成期給于麻醉藥不僅影響神經(jīng)前體細(xì)胞增殖,還影響存活和整合到回路中,而異丙酚作用靶點(diǎn)主要為GABA受體,因此,也將可能對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和發(fā)育產(chǎn)生影響。側(cè)腦室下帶和海馬齒狀回是神經(jīng)發(fā)生的兩個(gè)重要區(qū)域,對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有著重要的功能,異丙酚對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)增殖產(chǎn)生影響也可能影響成年后認(rèn)知功能。
　　 體內(nèi)外的研究結(jié)果提示,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、EG

10、F和bFGF能夠促進(jìn)神經(jīng)元的再生。BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的重要一員,主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、基底前腦、紋狀體等膽堿能神經(jīng)元中。研究表明,BDNF不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)和維持神經(jīng)元正常的生理功能起關(guān)鍵作用,而且還可以通過(guò)前膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶發(fā)揮作用,并且可以調(diào)節(jié)突觸傳遞易化。BDNF的營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)軸突生長(zhǎng)的作用是通過(guò)與其特異性的高親和力受體TrkB結(jié)合而發(fā)揮的。有研究報(bào)道全麻抑制神經(jīng)存活及軸突發(fā)

11、育所需的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,比如腦源性營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)。米衛(wèi)東等報(bào)道腹腔注射50mg/kg以上劑量異丙酚對(duì)缺血性腦損傷沙土鼠海馬神經(jīng)元增殖有抑制作用,可能的原因?yàn)闇p少BDNF及作用受體TrkB蛋白含量有關(guān)。
　　 那么異丙酚作為臨床上常用的靜脈全麻藥,對(duì)發(fā)育中大腦神經(jīng)增殖有沒(méi)影響呢?如果有影響,那么是增強(qiáng)還是抑制?與劑量、時(shí)間有無(wú)關(guān)系?影響的作用機(jī)制是怎樣?對(duì)成年后學(xué)習(xí)、記憶能力

12、有沒(méi)影響?基于此,本研究選用出生后7天的wistar幼鼠,分單次或者重復(fù)注射異丙酚,用Brdu染色觀察對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)檢測(cè)與神經(jīng)干細(xì)胞存活有關(guān)蛋白BDNF的表達(dá),探討可能的機(jī)制,用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察異丙酚重復(fù)鎮(zhèn)靜對(duì)成年后大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響,進(jìn)一步明確成年后行為功能與增殖之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討異丙酚在產(chǎn)科和兒科手術(shù)使用的安全性,從而更好的指導(dǎo)其在嬰幼兒中的運(yùn)用。
　　 第1部分異丙酚對(duì)鼠發(fā)育中大腦神經(jīng)干

13、細(xì)胞增殖及幼鼠成年后空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　 1.方法:
　　 1.1.異丙酚麻醉ED95測(cè)定
　　 選擇7日齡wister幼鼠,隨機(jī)分為40、60、80、100mg/kg異丙酚劑量組。腹腔注射5分鐘后測(cè)甩尾反射,然后在各組異丙酚劑量的對(duì)數(shù)值與甩尾反射陰性率之間建立回歸方程,根據(jù)概率單位法計(jì)算異丙酚使95％實(shí)驗(yàn)幼鼠對(duì)傷害性刺激無(wú)甩尾反射所需異丙酚劑量即ED95。
　　 1.2.血?dú)夥治?br>　　

14、為了排除缺血、缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞損害,選擇20只7日齡幼鼠,分為異丙酚組與對(duì)照組,每組10只,分別測(cè)定異丙酚100mg/kg處理組與對(duì)照組的動(dòng)脈血?dú)?檢測(cè)PH、PCO2、HCO3-、PO2。
　　 1.3.單次異丙酚給藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠40只隨機(jī)分為數(shù)量平均的四組,每組10只。各組分別腹腔注射生理鹽水10ml/kg、脂肪乳劑10ml/kg、異丙酚50mg/kg、異丙酚100mg/kg,

15、然后腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后灌注切腦片做Brdu免疫組化。
　　 1.4.重復(fù)異丙酚給藥對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠64只隨機(jī)分為數(shù)量平均的四組,每組16只。各組分別腹腔注射生理鹽水10ml/kg、脂肪乳劑10ml/kg、異丙酚50mg/kg、異丙酚100mg/kg,連續(xù)注射7天,第7天腹腔注射300mg/kg Brdu,12h后每組取10只灌注切腦片做Brdu免疫組化,6只取

16、海馬提蛋白westerblot檢測(cè)BDNF。
　　 1.5.重復(fù)異丙酚給藥對(duì)成年后學(xué)習(xí)記憶的影響
　　 將同窩出生的7日齡幼鼠20只隨機(jī)分為生理鹽水組10ml/kg、異丙酚100mg/kg兩組,每組10只。各組均為腹腔注射,連續(xù)注射7天,麻醉蘇醒后放回母鼠飼養(yǎng),飼養(yǎng)兩月成年后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1異丙酚麻醉劑量ED95
　　 各組幼鼠給藥

17、后鼻唇,趾端膚色紅潤(rùn),無(wú)發(fā)紺,呼吸頻率稍偏慢。在各組異丙酚的對(duì)數(shù)劑量(Y)與甩尾反射陰性率相對(duì)的概率單位(X)間建立直線回歸方程:Y=0.103x+1.292,查反對(duì)數(shù)表得到使95％甩尾反射陰性率的異丙酚劑量為:94.48mg/kg,幼鼠異丙酚麻醉劑量ED95為94.48mg/kg。
　　 2.2血?dú)夥治鼋Y(jié)果
　　 異丙酚組血?dú)夥治鼋Y(jié)果與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異,其中異丙酚處理后PH略有下降,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.622,

18、P=0.122)；PO2在兩組間比較沒(méi)有顯著差異(t=1.541,P=0.141)；PCO2在異丙酚處理后稍升高,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.397,P=0.179)；兩組間的HCO3-沒(méi)有顯著差異(t=-1.510,P=0.148)。
　　 2.3異丙酚單次注射后對(duì)鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的影響
　　 各組新生鼠的海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見(jiàn)一些分布不均勻,形狀不規(guī)則的BrdU染色陽(yáng)性的棕色顆粒,這些棕色顆粒即

19、為新生的神經(jīng)元前體細(xì)胞。四組之間BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著差異(F=1.009,P=0.391)。
　　 2.4異丙酚重復(fù)注射后對(duì)鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的影響
　　 各組新生鼠的海馬齒狀回均可見(jiàn)一些分布不均勻,形狀不規(guī)則的BrdU染色陽(yáng)性的棕色顆粒,這些棕色顆粒即為新生的神經(jīng)元前體細(xì)胞,四組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(F=250.84,P=0.000),其中對(duì)照組與脂肪乳劑組沒(méi)有差異(P=0.380)

20、,與對(duì)照組相比,異丙酚處理組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有顯著差異(p=0.000),其中異丙酚100mg/kg組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)又明顯少于異丙酚50mg/kg組(p=0.000)。
　　 2.5 Morris水迷宮結(jié)果
　　 分別比較對(duì)照組和異丙酚組大鼠的逃逸潛伏期及平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間比值,水迷宮訓(xùn)練2天后即第三天大鼠逃避潛伏期縮短,但兩組逃逸潛伏期開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異(P=0.000),與對(duì)照組相比,異丙酚100mg/

21、kg組潛伏期延長(zhǎng)。在第五天空間搜索能力測(cè)試中,異丙酚組在平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間比值明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 2.6異丙酚重復(fù)注射后對(duì)大鼠海馬BDNF蛋白含量的影響
　　 為了檢測(cè)重復(fù)注射異丙酚對(duì)海馬BDNF蛋白含量的影響,應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)BDNF。以BDNF條帶灰度數(shù)值比β-actin條帶灰度數(shù)值所得百分?jǐn)?shù)為結(jié)果數(shù)值。方差分析結(jié)果顯示各組間均數(shù)存在顯著性差異(F=50.958,P

22、=0.000),對(duì)照組與脂肪乳劑組BDNF含量最高,兩組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.538),與對(duì)照組相比,異丙酚組含量明顯減少(p=0.000),其中100mg/kg異丙酚組含量又明顯少于50mg/kg異丙酚組(P=0.007)。
　　 3.結(jié)論:
　　 1)異丙酚麻醉新生鼠的ED95為94.48mg/kg。腹腔注射100mg/kg異丙酚麻醉后與麻醉前動(dòng)脈血?dú)鉄o(wú)顯著差異。
　　 2)與對(duì)照組相比,異丙酚單次給藥

23、后海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異,但重復(fù)給藥7天后海馬齒狀回BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)。
　　 3)成年后Morris水迷宮測(cè)試顯示,異丙酚組幼鼠從第三天逃逸潛伏期顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而平臺(tái)像限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間百分?jǐn)?shù)則顯著短于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 4)反復(fù)注射異丙酚組的BDNF蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 第2部分異丙酚對(duì)鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡

24、影響及作用機(jī)制研究
　　 1.方法:
　　 選擇孕14-16d Wistar大鼠,分離培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞,取第2代神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免疫熒光法染色鑒定,分別用5,25,50和100μmol/L的異丙酚進(jìn)行處理,并同時(shí)設(shè)立脂肪乳劑組和空白對(duì)照組,添加Brdu培養(yǎng)24h后采用免疫組化法標(biāo)記BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,DAPI復(fù)染細(xì)胞核；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)觀察異丙酚對(duì)胚胎神經(jīng)干

25、凋亡的影響；然后提取對(duì)照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時(shí)后的全細(xì)胞蛋白,用Western—blot檢測(cè)激活的細(xì)胞色素c、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá)。數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析,P值<0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.結(jié)果:
　　 2.1胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　 胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)后第二天長(zhǎng)

26、成大小不一的神經(jīng)球,懸浮在培養(yǎng)液中,傳代后神經(jīng)球生長(zhǎng)速度逐漸減慢。取第2代神經(jīng)球貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白Nestin免疫熒光法染色,將同一個(gè)培養(yǎng)皿中總細(xì)胞和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)后計(jì)算百分比作為該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Nestin陽(yáng)性的培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞占所有培養(yǎng)細(xì)胞的比例維持在90.36～93.90％。
　　 2.2異丙酚對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響
　　 空白對(duì)照組、脂肪乳劑組、5、25、50和100μmol/L異丙酚處理組

27、的細(xì)胞進(jìn)行BrdU的摻入和免疫細(xì)胞熒光檢測(cè),每次實(shí)驗(yàn)將48孔板的5個(gè)復(fù)孔中分別隨機(jī)取兩個(gè)視野的所有陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)相比后得到的百分比數(shù)作為該組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示各組間不存在顯著性差異(F=0.462,P=0.802),LSD法多重比較結(jié)果顯示異丙酚處理組間沒(méi)有差異,并不隨濃度改變而改變。
　　 2.3 MTT結(jié)果
　　 每次實(shí)驗(yàn)將96孔板的5個(gè)復(fù)孔中每個(gè)孔的MTT檢測(cè)數(shù)值與對(duì)照組所有MTT值的平均值相比后得到的

28、百分比數(shù),即標(biāo)準(zhǔn)化值作為該孔的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)在處理后各組間存在顯著性差異(F=3.584,P=0.015),LSD多重比較結(jié)果顯示空白對(duì)照組和脂肪乳劑組無(wú)顯著性差異,5-100μmol/L異丙酚處理24小時(shí)后細(xì)胞存活率下降,隨濃度升高而下降。
　　 2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果
　　 培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率各組間存在顯著性差異(F=247.733,P=0.000),空白對(duì)照組和脂肪乳劑處理12小時(shí)后

29、凋亡率無(wú)顯著性差異(P=0.900),但與異丙酚組有顯著差異(P=0.000),異丙酚處理組細(xì)胞凋亡率隨濃度升高逐漸升高,到50μmol/L濃度時(shí)達(dá)到最高峰,100μmol/L時(shí)細(xì)胞死亡率超過(guò)凋亡率。添加了caspase抑制劑的50μmol/L屏丙酚凋亡率顯著少于50μmol/L屏丙酚(P=0.000)。
　　 2.5異丙酚對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡通路上關(guān)鍵蛋白的影響
　　 1)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞caspase-

30、3水平
　　 空白對(duì)照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時(shí)后提取蛋白做激活的caspase-3免疫印跡,方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=47.495,P=0.000),50μmol/L屏丙酚組caspase-3條帶灰度值顯著高于脂乳劑組與空白對(duì)照組(P=0.000),添加抑制劑后激活的caspase-3含量顯著降低(P=0.000)。
　　 2)異丙

31、酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞Cytochrome C水平
　　 空白對(duì)照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時(shí)后提取蛋白做Cytochrome C免疫印跡,方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示Cytochrome C含量組間存在顯著性差異(F=114.717,P=0.000),50μg/mL異丙酚提高了Cytochrome C的水平,灰度值顯著高于脂肪乳劑組與空白對(duì)照組(P=0.000),但添

32、加抑制劑后Cytochrome C的含量減低,與未添加組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞caspase-9水平
　　 空白對(duì)照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時(shí)后提取蛋白做激活的caspase-9免疫印跡。條帶灰度值分析結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=135.975,P=0.000),與脂肪乳劑組與空白對(duì)照組相

33、比,50μg/mL異丙酚組caspase-9表達(dá)水平顯著提高(P=0.000),添加抑制劑后激活的caspase-9的表達(dá)水平下降(P=0.000)。
　　 4)異丙酚提高培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞caspase-8水平
　　 空白對(duì)照組、脂肪乳劑組、50μmol/L異丙酚、50μmol/L異丙酚+caspase抑制劑培育12小時(shí)后提取蛋白做激活的caspase-8免疫印跡。方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示組間均數(shù)存在顯著性差異(F=9.22

34、5,P=0.006),脂肪乳劑組caspase-8表達(dá)水平高于對(duì)照組(P=0.025),異丙酚提高了caspase-8的水平,灰度值明顯高于脂肪乳劑組與空白對(duì)照組(P>0.05),添加抑制劑后caspase-8的激活水平比未添加抑制劑異丙酚組顯著降低(P=0.009)。
　　 3.結(jié)論:
　　 1)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞Nestin陽(yáng)性比例維持在90.36～93.90％。
　　 2)不同濃度異丙酚對(duì)胚胎神經(jīng)干細(xì)胞增

35、殖沒(méi)有影響,但能降低細(xì)胞的存活率,其效應(yīng)呈劑量依賴型。
　　 3)異丙酚能引起胚胎神經(jīng)干細(xì)胞凋亡,其效應(yīng)呈劑量依賴型,100μmol/L異丙酚處理后細(xì)胞死亡率大于凋亡率。
　　 4)異丙酚處理后的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞激活的caspase-3、CytochromeC、caspase-9 caspase-8蛋白表達(dá)水平顯著增加。
　　 總結(jié):
　　 本研究分別以培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞和出生后7日齡新生鼠為模型,觀察了