臨床常見致病菌中喹諾酮類耐藥基因的多態(tài)性及功能研究.pdf

1、[目的]
　　細菌對喹諾酮類藥物耐藥性的不斷出現(xiàn)及耐藥率的不斷上升，使得我們對喹諾酮類耐藥基因的研究顯得尤為重要。本文旨在開展喹諾酮類耐藥基因在臨床常見致病菌中的種類、數(shù)量、多態(tài)性分布及基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等方面的研究，為進一步分析喹諾酮類耐藥基因相關(guān)的耐藥機制的研究打下基礎(chǔ)，并為臨床合理用藥和進行抗生素的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1、收集NCBI數(shù)據(jù)庫和ARDB耐藥基因庫收錄的喹諾酮類耐藥基因，去除冗余后提

2、取一致性序列，做為參考序列。
　　2、實驗室前期已完成金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等九類臨床常見致病菌的基因組提取和測序，本課題運用一系列的生物信息學(xué)軟件將以上提取的參考序列與測序所得的短序列進行比對分析，定位并收集喹諾酮類耐藥基因在九個樣本中的分布。
　　3、進一步分析九個樣本中喹諾酮類所有耐藥基因類型、豐度及潛在的多態(tài)性位點。并且為下一步實驗提供參考。
　　4、對金黃色葡萄球菌中norA-1、norB-7基因分別預(yù)

3、測啟動子序列并設(shè)計引物，PCR擴增技術(shù)篩選目的基因陽性菌，PCR產(chǎn)物測序并去除冗余序列后進行TA克隆及藥物敏感試驗，結(jié)合TA克隆株的測序結(jié)果與MIC結(jié)果分析norA-1、norB-7基因的多態(tài)性，驗證基因結(jié)構(gòu)與耐藥性功能的關(guān)系。
　　[結(jié)果]
　　1、NCBI數(shù)據(jù)庫及ARDB耐藥庫共收集到喹諾酮類耐藥基因9544條，去冗余序列后提取一致性序列107條作為參考序列。
　　2、九個樣本基因組中含有44種喹諾酮類耐藥基因，分

4、別交叉分布于金黃色葡萄球菌（23種）、糞腸球菌（13種）、銅綠假單胞菌（9種）、鮑曼不動桿菌（7種）、陰溝不動桿菌（7種）、肺炎克雷伯菌（6種）、大腸埃希菌(4種)、屎腸球菌（3種）及沙門氏菌（1種）。其中aac(6')-Ib-cr基因是九個樣本中最為流行的喹諾酮類耐藥基因，存在于六個樣本中;另有28種基因僅分布于單個樣本。
　　3、這44種基因涉及MFS家族有19種，涉及RND家族12種，酶編碼基因1種，質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因7種，

5、其余未知基因5種。金黃色葡萄球菌中多見MFS家族編碼基因，包括12種norB基因型及1種norA基因型，銅綠假單胞菌中多見RND家族編碼基因。
　　4、在233例金黃色葡萄球菌篩選到norA-1基因陽性菌180株及norB-7基因201株，陽性率均在80％以上。成功構(gòu)建33株norA-1基因克隆株及11株norB-7基因克隆株。藥敏結(jié)果表明33株norA-1克隆株中28株表現(xiàn)環(huán)丙沙星耐藥，18株左氧氟沙星耐藥，28株諾氟沙星耐藥。

6、68-1、69-2、83-2、155-2重組菌無喹諾酮類藥物耐藥性，58-3、82-1重組菌只對其中一種藥物有低水平耐藥。大多數(shù)norB-7克隆株對喹諾酮類藥物敏感。
　　5、44株重組菌的測序結(jié)果（ORF區(qū)域）表明norA-1克隆株有106個位點存在多態(tài)現(xiàn)象，norB-7克隆株有37個位點存在多態(tài)現(xiàn)象。其中68-1、69-2、83-2、155-2、58-3、82-1重組菌ORF上游200bp區(qū)域存在3個突變位點，位于預(yù)測的啟動子

7、區(qū);ORF區(qū)域存在11個突變位點，包括3個同義突變及8個非同義突變，8個非同義突變位點中有7個位點位于預(yù)測的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)。
　　[結(jié)論]
　　1、新一代高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)工具結(jié)合非常適合用于篩選和分析混合樣本中的耐藥基因。
　　2.、金黃色葡萄球菌中喹諾酮類耐藥基因最多，占已檢出的喹諾酮類耐藥基因的50％;而九個樣本中最流行的是aac(6')-Ib-cr基因。
　　3、norA-1及norB-7基因在金黃