細(xì)胞因子基因多態(tài)性對(duì)血液病患者侵襲性真菌感染易感性影響的研究.pdf

1、背景與目的:侵襲性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)診斷困難、病死率高,是血液病患者尤其是異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic haematopoietic stem celltransplant,allo-HSCT)患者的一個(gè)重要生命威脅。隨著近年來血液病診斷、治療進(jìn)展以及支持治療改善,尤其是無關(guān)供者、HLA不合供者以及單倍體移植技術(shù)進(jìn)展,越來越多的患者進(jìn)行了allo—HSCT,血液病患者預(yù)后

2、有了極大的改善、生存期明顯延長(zhǎng),然而這也導(dǎo)致了IFI發(fā)生率的顯著提高,IFI已成為移植患者最重要的感染性死亡原因。然而盡管免疫抑制狀態(tài)相似,但并非所有患者最終發(fā)展為IFI。這引導(dǎo)我們關(guān)注患者自身的免疫狀況及其和IFI之間的關(guān)系。目前已知不同機(jī)體對(duì)感染性疾病的易感性有很大差別,宿主遺傳因素在此起了關(guān)鍵作用,同時(shí)宿主免疫機(jī)理決定了其對(duì)感染的反應(yīng)及病理結(jié)果。
　　 多態(tài)性(polymorphism)是指在一個(gè)生物群體中,同時(shí)和經(jīng)常存在

3、兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型(genotype)或等位基因(allele),亦稱遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism)或基因多態(tài)性。人類基因多態(tài)性在闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性,疾病臨床表現(xiàn)的多樣性,以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。通過基因多態(tài)性的研究,可以從基因水平揭示人類不同個(gè)體間生物活性物質(zhì)的功能及效應(yīng)存在著差異的本質(zhì)。尤其是IFI作為一種機(jī)會(huì)性感染,臨床表現(xiàn)、病理結(jié)果多樣,可以很好地闡釋宿主

4、遺傳學(xué)影響。
　　 細(xì)胞因子(cytokines)在抗真菌免疫中具有重要意義,Th1細(xì)胞因子(主要有IL-12、IFN-r、TYF-a、IL-6、IL-1)是主要的抗真菌免疫保護(hù)因素,激活中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞；而Th2細(xì)胞因子(主要有IL-4、IL-10)通過減少Th1細(xì)胞因子和疾病進(jìn)展、更多的組織損傷以及惡劣的預(yù)后相關(guān)。
　　 細(xì)胞因子由活化的免疫細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞)和某些基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、

5、分化,產(chǎn)生功能和維持生存的細(xì)胞間信號(hào)分子。細(xì)胞因子的合成、分泌和生物學(xué)效應(yīng)受細(xì)胞因子基因的調(diào)控,合成量個(gè)體差異很大,有的可相差10倍以上。差別的主要原因是細(xì)胞因子基因型的變異及基因調(diào)節(jié)區(qū)或啟動(dòng)區(qū)的多態(tài)性。
　　 國(guó)外進(jìn)行了一些關(guān)于免疫遺傳變異同IFI相關(guān)性的研究,發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫的一些主要成分與IFI易感性存在很大關(guān)聯(lián),如TLR4 Asp299Gly、Thr399Ile,TLR1Arg80Thr,TLR6 Asn248Ser、Ser

6、249Pro；MBL低產(chǎn)型(如MBL54G/A、HYPD單倍型等),MASP2 Asq472Asn；IL-15+13689A/T,TNF-a-308G/A,IFN-γ+874T/A,CXCL1011101C/T、1642C/G、-1101A/G等。但查閱現(xiàn)有文獻(xiàn)中國(guó)人群沒有發(fā)現(xiàn)TLR4Asp299Gly、Thr399Ile多態(tài)性；且亞洲人群MBL2基因第一外顯子以第54位密碼點(diǎn)突變?yōu)橹?有文獻(xiàn)報(bào)道廣東地區(qū)漢族人群MBL54G/A突變頻率

7、為0.05。某些細(xì)胞因子突變頻率則很高,如有文獻(xiàn)報(bào)道廣東漢族人群TNF-a-308 G/A突變頻率為0.354,IFN-γ+874T/A突變頻率為0.293,故我們僅選擇這些在中國(guó)人群中高突變基因行多態(tài)性的研究,探討其對(duì)IFI易感性的影響。
　　 國(guó)內(nèi)目前尚無關(guān)于IFI最高危人群—血液腫瘤患者IFI易感遺傳因素的報(bào)道,因基因多態(tài)性存在種族及地域差別,國(guó)外有關(guān)免疫遺傳變異并不一定適應(yīng)我國(guó)情況,故而研究我國(guó)IFI相關(guān)的免疫基因多態(tài)性

8、有著重大意義。根據(jù)我國(guó)人群基因多態(tài)性的特點(diǎn),我們選擇細(xì)胞因子基因多態(tài)性為研究靶點(diǎn),以血液病患者為研究對(duì)象,探討IFI易感的遺傳因素,希望實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫抑制患者,尤其是惡性血液病患者IFI發(fā)生危險(xiǎn)性的分層預(yù)測(cè)的可能性,也為IFI診斷標(biāo)準(zhǔn)中宿主因素的分層提供依據(jù),為探討對(duì)惡性血液病患者施行個(gè)性化的預(yù)防、治療策略提供依據(jù)。
　　 方法
　　 一.長(zhǎng)短療程伊曲康唑一級(jí)預(yù)防下allo-HSCT患者IFI發(fā)生狀況的觀察1.病例資料:20

9、08年8月至2010年11月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科接受allo-HSCT的血液病患者共163例,其中102例符合入組條件,隨機(jī)分配分別接受長(zhǎng)、短療程(預(yù)防用藥分別至移植后90天和移植后30天)伊曲康唑真菌一級(jí)預(yù)防。其中長(zhǎng)療程組48例,短療程組54例。常規(guī)行預(yù)處理、GVHD預(yù)防、支持治療等,隨訪至2010-12—31,中位隨訪時(shí)間298.5天。
　　 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)全部資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,定量資料用t

10、檢驗(yàn),定性資料用x2檢驗(yàn)。
　　 二.細(xì)胞因子基因多態(tài)性對(duì)血液病患者IFI易感性的研究
　　 1.病例選擇:從南方醫(yī)院血液科有完整病史資料,具備長(zhǎng)期隨訪條件的血液病患者中,選擇接受至少大于2個(gè)療程化療或接受allo-HSCT且有IFI患者(確診或臨床診斷)53例,其中接受allo-HSCT?；颊?6例；正常對(duì)照組選擇籍貫匹配的健康正常人65例。
　　 2.血樣采集:采集患者或健康對(duì)照者外周血樣2ml,移植患者采集

11、其供者外周血或完全植入后的受者外周血,-20度保存。
　　 3.對(duì)IFI患者和健康正常人進(jìn)行細(xì)胞因子基因多態(tài)性分析:采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶法(PCR-RFLP)分析TNF-a-308G/A、TGFβ1+869C/T多態(tài)性；序列特異性引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)分析IFN-γ+874T/A多態(tài)性。
　　 4.采用描述性分析對(duì)各基因突變類型進(jìn)行分析；采用Pearson x2檢驗(yàn)比較基因分布頻率、各基因型和等位

12、基因在IFI患者和健康對(duì)照中有無差異,采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果
　　 1.我院102例接受長(zhǎng)、短療程伊曲康唑真菌一級(jí)預(yù)防的allo—HSCT患者90天、180天、12月的OS分別為89.8％、83.2％、76.8％。真菌感染發(fā)生情況:移植后30天、90天、180天、12月時(shí)IFI發(fā)生率分別為7.84％、9.80％、10.78％和24.51％,和文獻(xiàn)報(bào)道相符。長(zhǎng)、短療程兩組真菌突破率分別為10.4

13、％和7.4％,移植后30天、90天、180天、12月時(shí)IFI感染率分別為分別為8.3％和7.4％；10.4％和9.3％:10.4％和11.2％；10.4％和21.4％,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.643),兩組患者生存率亦無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.TNF-a-308G/A、TGFβ1+869C/T、IFN-γ+874T/A的基因型分布頻率IFI組與健康對(duì)照組:TNF-α-308位點(diǎn)GG和非GG的基因型在IFI組中的

14、分布頻率分別為71.7％、28.3％,在健康對(duì)照組中分別為44.6％、45.4％。兩組間GG和非GG基因型分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=8.726,P=0.003)。TGF-β1+869位點(diǎn)CC和非CC基因型在IFI組的分布頻率分別為45.3％、54.7％；在健康對(duì)照組中分別為21.54％、78.46％。兩組間各基因型分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=7.539,P=0.006)。IFN-γ+874位點(diǎn)TT和非TT基因型在IFI組的分布頻率

15、分別為32.1％、67.9％；在健康對(duì)照組中分別為21.54％、78.46％。兩組間各基因型分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=5.647,P=0.017)。
　　 3.TNF-a-308G/A、TGFβ1869C/T、IFN-γ+874T/A基因型與IFI易感性的關(guān)系
　　 3.1.TNF—a-308基因型與IFI易感性的關(guān)系
　　 ①TNF-a-308基因型對(duì)IFI易感性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。相對(duì)于GG

16、型,非GG型(GA、AA)是IFI發(fā)生的保護(hù)性因素(OR=0.318,95％CI=0.147-0.688)。
　　 ②攜帶A等位基因者不易發(fā)生IFI,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=9.279,P=0.002)。攜帶A等位基因是IFI的保護(hù)因素(OR=0.386,95％CI=0.207-0.720)。
　　 3.2.TGFβ1869C/T基因型與IFI易感性的關(guān)系OTGF-β1基因型對(duì)IFI易感性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003

17、),相對(duì)于CC基因型,非CC型(CT、TT)是IFI發(fā)生的保護(hù)因素(OR=0.302,95％CI=0.134-0.681)。
　　 ②攜帶T等位基因者不易發(fā)生IFI,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=5.259,P=0.022)。攜帶T等位基因是IFI的保護(hù)因素(OR=0.545,95％CI=0.324-0.918)。
　　 3.3.IFN-γ+874T/A基因型與IFI易感性的關(guān)系
　　 ①IFN-γ+874基因型對(duì)I

18、FI易感性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017),相對(duì)于非TT(TA、AA)基因型,TT型是IFI發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=2.938,95％CI=1.183-7.300)。
　　 ②攜帶T等位基因或A等位基因?qū)FI無影響(x2=3.049,P=0.081)。
　　 結(jié)論
　　 1.長(zhǎng)、短療程伊曲康唑真菌預(yù)防療效及移植后生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.IFI組和健康對(duì)照組TNF-a-308、TGFβ1869、IF

19、N-γ+874基因型分布頻率存在差異。
　　 3.TNF—a-308G/A多態(tài)性與IFI發(fā)生有關(guān):相對(duì)于GG型,GA、AA型是IFI發(fā)生的保護(hù)因素,攜帶A等位基因是發(fā)生IFI的保護(hù)因素。
　　 4.TGFβ1869C/T多態(tài)性與IFI發(fā)生有關(guān):相對(duì)于CC型,TC、TT型是IFI發(fā)生的保護(hù)因素,攜帶T等位基因是發(fā)生IFI的保護(hù)因素。
　　 5.IFN-γ+874T/A多態(tài)性與IFI發(fā)生有關(guān):相對(duì)于非TT基因型,TT