pND6-1質粒中重復萘降解基因的鑒定和生態(tài)意義.pdf

1、許多細菌具有降解環(huán)境中生物異源物質的能力，其降解基因常位于質粒上。萘是常見的環(huán)境污染物，在工業(yè)廢水中的檢出率高達10％。ND6是本實驗室分離的高效降解萘的菌株，它可以在無機鹽液體培養(yǎng)基中于48h內將2g/L的萘降解98％。該菌株含有兩個大質粒，其中與萘降解有關的是101858bp的質粒pND6-1，另一個122055bp的質粒pND6-2功能不明。pND6-1中9個萘降解基因(nahAaAbAcAdBFCED)構成上游操縱子，它們編碼的

2、酶催化萘降解成水楊酸，另外11個萘降解基因(nahGTHINLOMKJY)構成下游操縱子，負責將水楊酸降解成兒茶酚，并通過間位裂解途徑將兒茶酚進一步降解成可以進入三羧酸循環(huán)的小分子物質。 尼龍寡聚體質粒pOAD2、2,4-D質粒pJP4及萘降解菌PseudomonasstutziriAN10的染色體上都存在重復降解基因。重復降解基因的存在并非偶然事件，它是細菌為了適應環(huán)境長期進化的結果。生物信息學分析表明，萘降解質粒pND6-1

3、中除了“經典”的水楊醛脫氫酶基因nahF和水楊酸羥化酶基因nahG外，還存在它們的重復基因nahV和nahU，這兩個重復基因分別位于萘降解的上游操縱子和下游操縱子之外。 本論文的主要研究內容是：通過16SrRNA基因序列分析和Biolog代謝指數測定確定ND6菌株的分類地位；通過濾膜雜交實驗確定pND6-1質粒能否進行接合轉移；克隆和表達兩個重復的萘降解基因nahV和nahU并對它們編碼的酶進行純化和鑒定；通過DNA雜交實驗證明

4、nahU基因存在的普遍性并對其生態(tài)意義進行探討。 對ND6菌株的16SrRNA基因序列所進行的PCR擴增、克隆、測序和Blast分析表明，它與假單胞菌屬的多株細菌具有99％的同源性。Biolog代謝指數測定結果顯示ND6菌株與惡臭假單胞菌的匹配程度為0.65。綜合上述兩項實驗結果，ND6菌株被鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonaseputida)。 濾膜雜交實驗表明，ND6菌株的pND6-1質?？梢酝ㄟ^接合作用轉移到

5、大腸桿菌AD256菌株中。由于ND6菌株不含有接合轉移基因，所以推測pND6-2質粒中的8個接合基因與pND6-1質粒的轉移有關。這是第一個報道，一個質粒的接合基因可以促進另外一個降解質粒的轉移。 以pND6-1為模板，設計引物分別對重復的水楊醛脫氫酶基因nahV和重復的水楊酸羥化酶基因nahU進行PCR擴增，然后分別在高表達載體pET-21b(+)中定向克隆，并在E.coliBL21(DE3)細胞中于20℃低溫表達。將C-端帶

6、有HisTag的重組蛋白通過Ni-NTA親和層析加以純化，然后對兩種新酶NahV和NahU的酶學性質進行詳細研究，并與它們對應的同工酶NahF和NahG的性質進行比較。 NahV具有廣泛的底物范圍，它能以水楊醛、5-氯水楊醛、間硝基苯甲醛、辛醛、甲醛、鄰硝基苯甲醛、鄰甲氧基苯甲醛、戊二醛和乙二醛為底物進行催化反應，而且NahV和NahF對不同底物的催化效率不同。NahV對底物水楊醛和輔酶NAD+的米氏常數Km值及最大反應速度Vm

7、ax都小于NahF，這表明NahV對底物濃度更加敏感，相對更低的底物濃度就可以促進酶促反應的發(fā)生，但是在相同底物濃度的情況下NahF催化的反應速度要比NahV快。Fe2+對NahV和NahF都有顯著的激活作用，而Cu2+、Zn2+只對NahV有激活作用。生物信息學分析發(fā)現，水楊醛脫氫酶重復基因nahV與其它菌株的水楊醛脫氫酶的氨基酸序列同源性僅為56％，是完全不同的新基因。所有醛脫氫酶都具有保守的氨基酸序列LELGGKSP，但是在Nah

8、V的保守氨基酸序列中，絲氨酸(S)被丙氨酸(A)所替換。GPC凝膠色譜分析結果表明，NahV蛋白可能由兩個相同的亞基構成。 NahU也具有廣泛的底物范圍，能以水楊酸、乙酰水楊酸、磺基水楊酸、甲基水楊酸、氯代水楊酸和3,5-二硝基水楊酸為底物進行催化反應。NahU對底物水楊酸和輔酶NADH的Km值和Vmax值都要大于NahG。核酸序列比較表明，水楊酸羥化酶重復基因nahU是與nahG和另一個重復基因nahW都不相同的新基因。Nah

9、U和NahG都屬于單加氧酶家族，它們都擁有輔酶FAD的結合位點GxGxxG。 以質粒pND6-1上“經典”的水楊酸羥化酶基因nahG和重復的水楊酸羥化酶基因nahU為探針，分別與分離自紀莊子污水處理廠的活性污泥和大港油田及天津香料廠混合廢水的萘降解菌的總DNA雜交，結果表明，在被檢測的14個菌株中都存在nahG基因，而nahU基因只存在于來自混合工業(yè)廢水的菌株中。這表明，類nahU基因廣泛存在于自然界的萘降解細菌中，但不是必需的