高通量篩選評價典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物細胞毒性及其雌激素效應(yīng).pdf

1、隨著人類工業(yè)化進程的不斷推進,大量化學物質(zhì)在環(huán)境中不合理釋放,目前,全球已知的化學品有700萬之多,進入環(huán)境并日常接觸使用的已達數(shù)十萬余種,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確認多種化合物屬于內(nèi)分泌干擾物。這些化學品進入環(huán)境后,可模擬或抑制內(nèi)源性激素的生物效應(yīng),改變信號傳遞過程,干擾內(nèi)源性激素的產(chǎn)生從而造成內(nèi)分泌功能紊亂。近年來,有關(guān)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究己越來越受到各國的廣泛關(guān)注。發(fā)達國家以巨大的投入在研究環(huán)境激素的種類、污染途徑、主要污染源、生態(tài)危害、分子

2、作用機理、污染控制和防治對策方面進行了大量的工作。美國EPA和NIH于1998年8月開始實施內(nèi)分泌干擾物篩選計劃,日本環(huán)境廳發(fā)表“環(huán)境類激素戰(zhàn)略規(guī)劃公告”,于1999年正式啟動了環(huán)境類激素篩選計劃。歐洲各國普遍建立政府行為的研究中心,實施環(huán)境激素的研究計劃。據(jù)估計,發(fā)達國家在環(huán)境激素的研究方面已經(jīng)投入了數(shù)十億美元。可是由于評價體系復(fù)雜,試驗周期長,且花費巨大,還有相當一部分化合物缺少必要的環(huán)境行為和毒理學數(shù)據(jù),因此建立高通量篩選評價潛在

3、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物毒理學效應(yīng)的方法已是現(xiàn)階段當務(wù)之急。
　　 在本研究中,我們進行了三方面的工作。首先通過化學光譜法高通量篩選了與遺傳信息載體DNA有相互作用的,具有潛在細胞毒性的化合物,并在免疫細胞RAW264.7和神經(jīng)細胞PC12體外細胞模型上,對其與細胞核DNA的相互作用和細胞毒性機理進行了研究;第二部分,采用了計算機分子模擬方法對一系列潛在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物進行了類雌激素效應(yīng)的高通量篩選,同時在人工重組轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)中對雌

4、激素活性進行了高通量評價和驗證。最后我們選擇具有典型雌激素效應(yīng)的手性有機氯農(nóng)藥三氯殺蟲酯,結(jié)合計算機模擬技術(shù)在兩種不同的細胞模型中對其類雌激素效應(yīng)和對生殖健康潛在影響的分子機理進行了研究,結(jié)論如下:
　　 1.紫外光譜法結(jié)果顯示,功夫菊酯(lambda-cyhalothrin,λ-LCT)與小牛胸腺DNA(ctDNA)相互作用最為明顯。RAW264.7細胞毒性實驗的結(jié)果表明:λ-LCT對小鼠巨噬細胞具有顯著的細胞毒性,其細胞毒性

5、可能與λ-LCT介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和DNA損傷有關(guān)。
　　 2.熒光光譜法篩選了16種農(nóng)藥對DNA-EB熒光強度的影響,結(jié)果顯示聯(lián)吡啶類除草劑敵草快(diquat,DQ)能夠誘導(dǎo)DNA-EB體系發(fā)生熒光淬滅,因此選擇DQ作為目標化合物,對其在PC-12細胞上的細胞毒性進行評價。結(jié)果表明:DQ對PC-12細胞具有明顯的毒性,呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,并可以導(dǎo)致細胞核染色質(zhì)凝聚。我們認為DQ與DNA通過靜電相互作用是其潛在的細胞毒性的一個可能

6、原因。
　　 3.我們通過人工重組轉(zhuǎn)基因酵母對多種菊酯類農(nóng)藥的雌激素效應(yīng)的對映體選擇性進行了高通量評價,結(jié)果表明,其中三種cis-聯(lián)苯菊酯(Cis-bifenthrin,Cis-BF)、氯菊酯(Permethrin,PM)和氰戊菊酯(Fenvalerate,Fen)具有明顯的雌激素活性對映體選擇性。Cis-BF的潛在雌激素效應(yīng)能力大小順序為:1S-cis-BF＞cis-BF＞1R-cis-BF。PM和Fen的外消旋體在轉(zhuǎn)基因酵母

7、系統(tǒng)中均未表現(xiàn)出明顯的雌激素效應(yīng),但它們的兩個對映體均能誘導(dǎo)報告基因的表達。分子對接技術(shù)為我們提供了一種有關(guān)研究手性配體與受體之間選擇性結(jié)合而引起對映體選擇的生物學差異的新方法。
　　 4.通過Molegro Virtual Docker(MVD)對接軟件篩選24種多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),隨后運用轉(zhuǎn)入人雌激素受體α(human Estrogen receptor alpha,hE

8、Rα)基因的工程酵母進一步評價18種多氯聯(lián)苯的雌激素效應(yīng),其中15種均具有不同程度的雌激素效應(yīng)。分子對接初篩結(jié)果的準確率達到了50％以上,這為今后采用基于分子對接的高通量篩選方法,對大規(guī)模數(shù)據(jù)庫化合物與靶標間的相互作用進行計算模擬奠定了基礎(chǔ),可以很大程度上實現(xiàn)快速檢測確定優(yōu)先污染物的目標;同時也將有助于今后分子間相互作用的機理研究。
　　 5.我們以三氯殺蟲酯(Acetofenate,AF)為模式化合物,對其在MCF-7和JEG