鵝細小病毒非結構和結構蛋白B細胞線性抗原表位區(qū)的篩選.pdf

1、鵝細小病毒病(GPVS)是雛鵝的烈性傳染病，又稱小鵝瘟或Derzsy's病。多發(fā)生于4日齡至20日齡以內(nèi)的雛鵝。發(fā)病率和死亡率可高達90％～100％。該病病原為鵝細小病毒(Gooseparvovirus，GPV)，能感染各種品種的雛鵝，也可以感染雛番鴨。目前，該病仍為養(yǎng)鵝業(yè)最主要的傳染病之一，造成巨大的經(jīng)濟損失。由于本病長期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展，所以需要一種，準確、簡便的診斷方法來對該病作出早期診斷；也需要通過分析病毒的抗原成分篩選合適的

2、肽段作為亞單位疫苗用于本病的免疫防治。但這種診斷試劑和亞單位疫苗的研制，必須建立在對病毒蛋白抗原性的研究之上。細小病毒都具有基因組短小，衣殼結構簡單的特點，所以更容易將它們無關的抗原成分篩除，在制造亞單位疫苗和重組診斷抗原上具有很多優(yōu)勢。本研究首先構建了含有GPVH1株非結構蛋白(NS1)和結構蛋白(VP1)基因的重組克隆載體pMD18-T-NS1和pMD18-T-VP1。經(jīng)測序鑒定正確后，分別作為截短表達片段PCR擴增的模板。

3、 ⑴為了對NS1蛋白(627aa)進行抗原表位作圖，設計了一套覆蓋整個NS1蛋白的短肽，這些短肽長為50～60個氨基酸，有10～15個氨基酸重疊。為了表達這些短肽，共設計合成了15對引物。將這些亞克隆的基因片段插入至原核表達載體pGEX-6P-1中，經(jīng)IPTG誘導獲得了表達。利用切膠純化的方法對表達蛋白進行了純化，純化蛋白經(jīng)抗GST單克隆抗體鑒定。應用GPVH1株活疫苗毒免疫的10周齡鵝血清對表達的15個重組蛋白的抗原性進行了檢測，We

4、sternblot結果表明，表達的融合蛋白NS(453-514)、NS(485-542)、NS(533-598)和NS(575-627)能被GPV免疫的鵝血清所識別。根據(jù)以上試驗結果，進一步設計表達了覆蓋NS1蛋白C末端453-627aa的7個截短短肽，這些短肽長為30個氨基酸左右，有10～15個氨基酸重疊。Westernblot結果表明，表達的融合蛋白NS(485-514)、NS(498-532)、NS(523-556)、NS(543

5、-573)、NS(564-598)和NS(599-627)能被GPV免疫的鵝血清所識別。 ⑵為了對VP1蛋白(732aa)進行抗原表位作圖，設計并表達了19個覆蓋整個VP1蛋白的短肽，這些短肽長為50～60個氨基酸，有10～15個氨基酸重疊。Westernblot結果表明，表達的融合蛋白VP(35-100)、VP(81-136)、VP(124-161)、VP(146-198)、VP(423-491)、VP(531-595)、VP

6、(616-669)和VP(678-732)能被GPV免疫的鵝血清所識別。根據(jù)以上試驗結果，進一步設計表達了16個覆蓋VP1蛋白抗原性片段的短肽，這些短肽長為30個氨基酸左右，有10～15個氨基酸重疊。Westernblot結果表明，表達的融合蛋白VP(35-63)，VP(50-81)，VP(111-145)，VP(136-161)，VP(423-453)，VP(462-491)，VP(531-560)，VP(548-577)，VP(61

7、6-647)，VP(634-669)，VP(678-706)和VP(697-732)能被GPV免疫的鵝血清所識別。 ⑶綜合上述試驗結果，GPVH1株NS1蛋白的B細胞線性抗原表位區(qū)位于NS1蛋白的羧基末端485～627aa;GPVH1株VP1蛋白的B細胞線性抗原表位區(qū)位于35～81aa、111～198aa、423～453aa、462～491aa、531～577aa、616～669aa和678～732aa。 ⑷對以體液免疫