不倒翁蟲CYP4基因克隆及在黃渤海不同PAHs污染海域的響應(yīng)表達(dá).pdf

1、根據(jù)已知 CYP4家族的保守氨基酸區(qū)域設(shè)計引物，應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，首次從我國近海廣泛分布的多毛類——不倒翁蟲(Sternaspis scutata)體內(nèi)克隆出細(xì)胞色素氧化酶CYP4基因cDNA序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示，該序列全長為1829bp，5’端非翻譯區(qū)27 bp，3’端非翻譯區(qū)272 bp，開放閱讀框?yàn)?530 bp，編碼509個氨基酸。該蛋白理論等電點(diǎn)為4.96，相對分子質(zhì)量為149744Da。為無信號

2、肽的具有一個跨膜區(qū)的親水性蛋白。疏水性最大為3.61，最小值為-3.99，均值為-0.265，整個多肽鏈中大多數(shù)氨基酸的分值較低，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸。推導(dǎo)的氨基酸序列中，第309~321氨基酸序列具有疏水螺旋I區(qū)EVDTFMFEGHDTT；第374~377氨基酸序列存在K螺旋特征基序 ExxR區(qū)；第447~456氨基酸序列符合 P450所具有的結(jié)構(gòu)保守共有序列血紅素結(jié)合區(qū)FxxGxxxCxG。經(jīng)Blast與GenBank中已知

3、物種的氨基酸序列進(jìn)行相似性比對，與多毛類雙齒圍沙蠶 Nereis aibuhitensis CYP4V亞家族基因(JQ867402）氨基酸相似性為58％，與多毛類綠沙蠶Alitta virens CYP4BB1、CYP342A1氨基酸相似性為29%、31%，與多毛類小頭蟲 Capitella capitata CYP4AT1相似性為35%。因此推斷不倒翁蟲 CYP4基因?qū)儆贑YP4V亞家族，提交GenBank獲基因登錄號為KM10486

4、4。
　　根據(jù)不倒翁蟲(Sternaspis scutata) CYP4 cDNA序列全長和actin mRNA序列設(shè)計合成引物，建立了不倒翁蟲 CYP4的熒光實(shí)時定量 PCR檢測方法，用于檢測棲息于沉積環(huán)境中不倒翁蟲 CYP4在我國黃渤海近岸不同海域的表達(dá)特征和規(guī)律，并通過氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對不倒翁蟲棲息的沉積物中16種PAHs組分進(jìn)行定量分析。根據(jù)實(shí)時定量PCR結(jié)果分析，各個海域不倒翁蟲 CYP基因表達(dá)均存在差異性，其中，大

5、連灣和紅沿河海域、長興島和秦皇島海域的不倒翁蟲CYP4基因的表達(dá)量間是存在顯著差異，其余的海域不倒翁蟲CYP4基因表達(dá)量間都存在極顯著差異。沉積物中多環(huán)芳烴含量由高到低依次為大連灣、紅沿河、長興島、金州灣、莊河、秦皇島海域。結(jié)合各海域沉積物中多環(huán)芳烴含量，分析了CYP基因表達(dá)量的變化與海域沉積物多環(huán)芳烴含量間的相關(guān)性。相關(guān)關(guān)系表明，黃渤海近岸海域中不倒翁蟲的CYP4相對表達(dá)量與沉積物中多環(huán)芳烴總量呈正相關(guān)（p=0.037），即沉積物中多