1、胎盤中11β--HSD2在子癇前期中作用的研究2、H2S對紅細(xì)胞攜氧功能的調(diào)控作用機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 主要圍繞11β-HSD2在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行研究。
　　子癇前期是妊娠期特有的疾病，嚴(yán)重影響著母體和胎兒的健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病死亡的主要原因之一。目前，針對子癇前期并沒有有效的診斷和治療措施，臨床上最有效的治療方法仍然是提前終止妊娠。胎盤被認(rèn)為在子癇前期發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)殡S著胎盤的娩出，子癇前期的相關(guān)癥狀也會隨之消失。但是，胎盤是通過何種機(jī)制參

2、與到子癇前期的發(fā)病過程中，尚未完全闡明。近年來，子癇前期二元發(fā)病理論被廣泛接受，即在子癇前期發(fā)病機(jī)制的第一階段，由于胎盤發(fā)育不良滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入能力受損，使胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞無法侵入子宮肌蛻膜和子宮螺旋動脈，從而子宮螺旋動脈無法從高阻力，低容量的血管轉(zhuǎn)變?yōu)榈妥枇?，高容量的血管。由于子宮螺旋動脈重構(gòu)障礙，胎盤無法得到充足的氧氣和血液供應(yīng)致使胎盤處于缺血缺氧的不良狀態(tài)。之后，在子癇前期發(fā)病機(jī)制的第二階段，胎盤處于缺氧缺血的狀態(tài)下會釋放大量有害的細(xì)

3、胞因子進(jìn)入到母體循環(huán)中，造成母體廣泛的內(nèi)皮功能紊亂，繼而造成母體出現(xiàn)高血壓，蛋白尿等癥狀。
　　糖皮質(zhì)激素在妊娠期間很多過程如胚胎著床，胎盤胎兒的生長發(fā)育以及胎兒的分娩中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。糖皮質(zhì)激素可以作用到胎盤、胎兒、胎膜等妊娠期組織。隨著妊娠期的進(jìn)行，母體和胎兒血液循環(huán)中的糖皮質(zhì)激素水平都會隨之升高，但母體循環(huán)中的糖皮質(zhì)激素升高水平是胎兒側(cè)的數(shù)倍。如果胎兒暴露在母體過量的糖皮質(zhì)激素水平之下，會導(dǎo)致胎兒生長發(fā)育不良。胎盤中

4、的11β-HSD2可以將有活性的糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的糖皮質(zhì)激素，從而可以阻止母體過量的糖皮質(zhì)激素進(jìn)入胎兒循環(huán)中。有研究顯示，子癇前期產(chǎn)婦胎盤中的11β-HSD2表達(dá)是降低的，糖皮質(zhì)激素水平是升高的。也有研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期SD大鼠皮下注射地塞米松會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)高血壓，蛋白尿等子癇前期相關(guān)癥狀。這些研究提示11β-HSD2可能參與到子癇前期的發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，但是11β-HSD2是通過何種機(jī)制參與到子癇前期的發(fā)病過程中，尚未闡明。由于子癇前期

5、二元發(fā)病理論被廣泛認(rèn)可，那么，胎盤中11β-HSD2表達(dá)異常是否是通過抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入功能和促進(jìn)胎盤釋放有害細(xì)胞因子進(jìn)入母體等過程參與到子癇前期發(fā)病過程中呢？因此，為了探究11β-HSD2在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用，分別在整體動物和離體細(xì)胞水平上，進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)探索。
　　結(jié)果:
　　1、妊娠期間抑制11β-HSD2活性可以導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生子癇前期相關(guān)癥狀。在大鼠妊娠期間(GD7.5-19.5)皮下注射11β-HSD2抑制

6、劑CBX180μg/d、360μg/d、720μg/d，3種劑量觀察抑制11β-HSD2之后是否會直接導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)子癇前期的相關(guān)癥狀。結(jié)果顯示:(1)CBX皮下注射給藥之后360μg/d和720μg/d兩組胎盤中11β-HSD2蛋白表達(dá)減少并且活性受到抑制。(2)CBX皮下注射給藥之后360μg/d和720μg/d兩組妊娠期大鼠出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、腎損害和胎兒生長受限等子癇前期相關(guān)癥狀。
　　2、胎盤特異性抑制11β-HSD2活性

7、導(dǎo)致妊娠期大鼠產(chǎn)生子癇前期相關(guān)癥狀。由于胎盤在子癇前期的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，建立了胎盤特異性抑制11β-HSD2活性的妊娠期大鼠模型。動物實(shí)驗(yàn)分為五組:空白對照組(CON)、CBX180μg/2d、CBX-NPs、CBX-SRC、CBX-CSA。從GD7.5開始尾靜脈給藥處理，每兩天1次持續(xù)到GD19.5。結(jié)果顯示:(1)只有帶有胎盤靶向多肽標(biāo)簽的CBX-CSA組大鼠胎盤中11β-HSD2的蛋白表達(dá)和酶活性是減少的。(2)胎盤

8、特異性抑制11β-HSD2之后妊娠期大鼠出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、腎損害和胎兒生長受限等子癇前期相關(guān)癥狀。
　　3、妊娠期(GD7.5-19.5)皮下注射地塞米松(DEX)導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生高血壓、蛋白尿、腎損害等子癇前期相關(guān)癥狀。
　　4、胎盤中11β-HSD2表達(dá)及其活性的異?？梢砸种铺ケP滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入。PAS、α-actin、CK免疫組化染色結(jié)果顯示，360μg/d和720μg/d兩組全身給藥動物模型和CBX-CSA組靶向給藥動

9、物模型胎盤中，滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮肌蛻膜和子宮螺旋動脈功能受損。
　　5、胎盤中11β-HSD2表達(dá)及其活性的異常可以導(dǎo)致子宮胎盤血流灌注不足。多普勒超聲結(jié)果顯示，全身給藥模型中360μg/d和720μg/d兩組妊娠期大鼠中子宮螺旋動脈，胎盤中母體通道，胎兒側(cè)臍動脈內(nèi)血流速度均受到抑制。
　　結(jié)論:
　　動物模型和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明，胎盤中11β-HSD2表達(dá)異?？梢詫?dǎo)致胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入功能受損和血管生成因子與抗血

10、管生成因子表達(dá)失衡，進(jìn)而參與到子癇前期的發(fā)生發(fā)展當(dāng)中。
　　第二部分 主要圍繞H2S對紅細(xì)胞攜氧功能的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究。
　　H2S是繼NO、CO之后被發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，可以參與調(diào)節(jié)人體很多生理和病理過程。H2S可以參與調(diào)節(jié)血管舒張，血管形成，炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等過程。機(jī)體是在L-半胱氨酸的相關(guān)代謝通路中產(chǎn)生H2S，其介導(dǎo)H2S產(chǎn)生的兩種酶分別是胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)。CSE和C

11、BS兩種酶可以將同型半胱氨酸和胱硫脒代謝產(chǎn)生L-半胱氨酸，在產(chǎn)生L-半胱氨酸的過程中會伴隨著H2S的釋放。CSE與CBS兩種酶在人體心血管系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)之中廣泛表達(dá)。有研究顯示，在缺氧應(yīng)激的環(huán)境下，機(jī)體很多組織和細(xì)胞如腦、肺、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等都會出現(xiàn)H2S生成減少的現(xiàn)象。課題組前期的研究也顯示，胎盤在缺氧的狀態(tài)下，CBS和CSE的蛋白表達(dá)降低，H2S的生成也隨之減少。
　　紅細(xì)胞是人體血液中最常見的細(xì)胞，其主要的生理

12、功能是負(fù)責(zé)氧氣的運(yùn)輸。紅細(xì)胞可以在肺臟中結(jié)合氧氣使細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾涎t蛋白，之后紅細(xì)胞隨血液流經(jīng)外周組織將血紅蛋白攜帶的氧氣釋放到外周組織之中。氧氣與血紅蛋白的親和性和氧分壓的關(guān)系可以用氧離曲線表示。氧氣與血紅蛋白結(jié)合為50％時的氧分壓稱之為P50，其可以反應(yīng)血紅蛋白與氧氣的親和能力。血紅蛋白與氧氣的結(jié)合和釋放受到很多因素如pH、溫度、2，3-二磷酸甘油酸(2，3-BPG)的調(diào)節(jié)。2，3-BPG可以變構(gòu)調(diào)節(jié)血紅蛋白的構(gòu)象，使其與

13、氧氣親和性降低，利于氧氣的釋放。2，3-BPG是通過紅細(xì)胞內(nèi)糖酵解通路產(chǎn)生的1，3-BPG在2，3-二磷酸甘油酸變構(gòu)酶(bisphosphoglycerate mutase，BPGM)的作用下生成的。2，3-BPG可以被2，3-二磷酸甘油酸磷酸酶降解，但是由于磷酸酶的活性較低，因此2，3-BPG在紅細(xì)胞內(nèi)蓄積并發(fā)揮作用。有研究顯示，人體在缺氧的環(huán)境下，紅細(xì)胞內(nèi)的2，3-BPG表達(dá)升高，使血液在流經(jīng)外周組織時釋放更多的氧氣。也有研究顯示，

14、人體在高海拔缺氧的環(huán)境下，隨著缺氧時間的增加，血清中H2S的水平也隨之減少。那么，H2S是否可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞中2，3-BPG的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的攜氧功能呢？為了解決上述問題，設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1、首先建立了Cse-/-基因敲除小鼠模型，之后收集野生型小鼠和Cse-/-小鼠的紅細(xì)胞進(jìn)行代謝組學(xué)的分析，結(jié)果顯示，兩組紅細(xì)胞有30種差異代謝物，其中Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中的2，3-BPG水平明顯升高。代謝組的結(jié)果提

15、示，H2S的減少可以導(dǎo)致紅細(xì)胞中2，3-BPG表達(dá)升高。
　　2、為了進(jìn)一步驗(yàn)證H2S對紅細(xì)胞攜氧功能的調(diào)節(jié)，采用2，3-BPG檢測試劑盒檢測紅細(xì)胞中2，3-BPG水平，結(jié)果與代謝組分析一致，Cse-/-小鼠紅細(xì)胞中的2，3-BPG水平明顯升高。之后，外源性的注射H2S供體GYY4137之后可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。同時，通過血?dú)夥治鰴z測了紅細(xì)胞的攜氧功能指標(biāo)氧離曲線和P50。結(jié)果顯示，H2S減少同樣會導(dǎo)致紅細(xì)胞氧離曲線右移和P50升高。

16、GYY4317處理Cse-/-小鼠之后可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
　　3、為了探究血清中H2S的來源，建立了Cse-/-基因敲除小鼠與野生型小鼠骨髓移植模型，分為3組:野生型小鼠骨髓移植到野生型小鼠(WT-WT)，野生型小鼠骨髓移植到Cse-/-小鼠(WT-Cse-/-)以及Cse-/-小鼠骨髓移植到野生型小鼠(Cse-/-WT)。結(jié)果顯示，紅細(xì)胞本身H2S的減少不會導(dǎo)致血清中H2S的改變，然而，外周組織H2S的減少會影響血清中的H2S水

17、平。同時，紅細(xì)胞攜氧能力檢測顯示，外周組織H2S減少會導(dǎo)致紅細(xì)胞2，3-BPG以及P50升高。GYY4317處理WT-Cse-/-組小鼠之后，可以逆轉(zhuǎn)2，3-BPG以及P50的升高。
　　4、為了探究H2S對紅細(xì)胞的直接作用，離體培養(yǎng)了人和小鼠的紅細(xì)胞，應(yīng)用GYY4137（250μM，500μM）處理之后，檢測紅細(xì)胞攜氧功能，結(jié)果顯示，H2S可以抑制紅細(xì)胞2，3-BPG和P50的水平并導(dǎo)致氧離曲線左移。
　　5、為了探究H2