人前梯度蛋白2對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：腸上皮屏障功能的損傷在IBD的發(fā)生、發(fā)展及疾病轉(zhuǎn)歸中均發(fā)揮重要作用。腸上皮屏障的完整性受一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中緊密連接復(fù)合體的失調(diào)及腸上皮細(xì)胞功能的破壞是導(dǎo)致腸上皮屏障功能缺陷的重要原因。緊密連接復(fù)合體位于上皮細(xì)胞周圍頂端，由跨膜蛋白Occludin，Claudins，JAM以及胞漿蛋白ZO-1，ZO-2，ZO-3等組成，是上皮機(jī)械屏障最重要的組成部分，決定細(xì)胞間通透性的主要因素，緊密連接復(fù)合體若被破壞，細(xì)胞間通透性就會(huì)增加，細(xì)

2、菌、內(nèi)毒素及毒性大分子物質(zhì)則可進(jìn)入體循環(huán)，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，而上皮細(xì)胞F-actin的重組和/或再分布也可以引起腸上皮屏障通透性改變。此外，腸上皮細(xì)胞增殖及重建是維持腸屏障完整性的另一重要因素，在損傷后，為了重新恢復(fù)上皮屏障完整性及胃腸功能，腸上皮細(xì)胞需要增生及遷移到損傷部位，從而參與屏障的損傷修復(fù)。TNF-α是一個(gè)多功能促炎因子，已被證實(shí)在IBD發(fā)病中起關(guān)鍵作用，能夠破壞腸道緊密連接功能，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，引起細(xì)胞膜通透性增高及炎癥

3、因子IL8，IL17，IFN-γ等釋放增加，同時(shí)影響腸上皮細(xì)胞增殖和凋亡途徑，最終破壞腸上皮屏障的完整性，導(dǎo)致潰瘍及膿腫形成。人前梯度蛋白2(Anteriorgradient protein2 homologue，AGR2)作為蛋白二硫化物異構(gòu)酶家族成員之一，已被證實(shí)在維持IBD腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。AGR2基因突變?nèi)巳侯净伎肆_恩病及潰瘍性結(jié)腸炎的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，在IBD動(dòng)物模型中，AGR2能夠維持小鼠腸道潘氏細(xì)胞及杯狀細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，AG

4、R2基因敲除小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激增加，易發(fā)展為嚴(yán)重的結(jié)腸回腸炎。以上研究表明AGR2對(duì)于IBD腸上皮細(xì)胞功能的維持發(fā)揮重要保護(hù)作用，但能否調(diào)控腸上皮屏障功能尚不清楚。本研究首次探討AGR2在TNF-α介導(dǎo)的腸上皮屏障損傷中的作用及其機(jī)制。
　　方法：通過(guò)體外培養(yǎng)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco2細(xì)胞21天左右建立腸上皮屏障模型，加入rhTNF-α刺激損傷細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)AGR2mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)AGR2蛋白表達(dá)

5、，初步確定AGR2基因在TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷中的表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建AGR2質(zhì)粒，在建好的腸上皮屏障模型中預(yù)先轉(zhuǎn)染AGR2質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組加入rhTNF-α刺激細(xì)胞，48小時(shí)后，應(yīng)用跨膜電阻和熒光黃透過(guò)率檢測(cè)細(xì)胞膜通透性，Western blot檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，Claudin-1及MLCK-P-MLC通路蛋白，NF-κBp65, YAP, p-YAP(S127), LATS1/2, P-

6、LATS1/2, P-MST1/2, cyclinD1, cyclinE1蛋白表達(dá)情況，免疫熒光染色觀察緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，細(xì)胞骨架F-actin及NF-κB P65分布情況，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，最后應(yīng)用YAP蛋白特異性抑制劑維替泊芬來(lái)驗(yàn)證AGR2改善TNF-α誘導(dǎo)的腸屏障損傷的機(jī)制，同樣在建好屏障的Caco-2細(xì)胞中預(yù)先轉(zhuǎn)染AGR2和對(duì)

7、照質(zhì)粒，24小時(shí)后先加入維替泊芬，2小時(shí)后加入TNF-α，48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)及定位，細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力。
　　結(jié)果：⑴TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷模型中，AGR2 mRNA及蛋白水平表達(dá)均下降。⑵在TNF-α誘導(dǎo)的腸屏障損傷模型中，細(xì)胞膜通透性明顯升高，表現(xiàn)為跨膜電阻下降和熒光黃透過(guò)率上升，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為ZO-1，Occludin，Claudin-1蛋白表達(dá)下調(diào)，免疫熒光結(jié)果顯示在正常對(duì)照組，緊密

8、連接蛋白位于細(xì)胞連接處，表現(xiàn)為連續(xù)的沿細(xì)胞邊界環(huán)繞的帶狀結(jié)構(gòu)，連接緊密，無(wú)明顯間隙，應(yīng)用rhTNF-α刺激細(xì)胞48小時(shí)后，緊密連接蛋白邊緣粗糙呈鋸齒狀分布，在細(xì)胞的交界處可見(jiàn)不連貫的缺口或裂隙樣表現(xiàn)，細(xì)胞骨架發(fā)生重排，而預(yù)先轉(zhuǎn)染AGR2質(zhì)?？擅黠@抑制TNF-α引起的腸屏障損傷，表現(xiàn)為抑制腸上皮細(xì)胞通透性增加，可明顯減輕TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接蛋白表達(dá)下降及結(jié)構(gòu)破壞，抑制細(xì)胞骨架重排。⑶在TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損傷中，NF-κBP65

9、-MLCK-P-MLC通路活化，而AGR2可抑制其活化，表現(xiàn)為MLCK蛋白表達(dá)減少及MLC磷酸化水平下降，NF-κB P65蛋白表達(dá)減少，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)NF-κB P65核內(nèi)移減少。⑷通過(guò)CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示TNF-α可明顯抑制腸上皮細(xì)胞增殖，而AGR2可抑制TNF-α引起的腸上皮細(xì)胞增殖活性下降，進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，TNF-α刺激細(xì)胞組G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例減少

10、，而AGR2過(guò)表達(dá)組抑制TNF-α引起的G0/G1期細(xì)胞阻滯，使細(xì)胞周期順利從G0/G1期向S期和G2/M期過(guò)渡。而在凋亡檢測(cè)結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激組細(xì)胞凋亡明顯增加，而AGR2過(guò)表達(dá)組可抑制TNF-α引起的細(xì)胞凋亡增加。⑸在細(xì)胞遷移能力檢測(cè)中，我們發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，TNF-α組細(xì)胞遷移能力明顯減弱，而預(yù)先轉(zhuǎn)染AGR2質(zhì)?？梢种芓NF-α引起的細(xì)胞遷移能力下降。⑹進(jìn)一步探討AGR2改善TNF-α誘導(dǎo)的腸屏障損傷的機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)加

11、入TNF-α刺激后，YAP蛋白表達(dá)明顯下降，而其磷酸化水平明顯增加，而預(yù)先轉(zhuǎn)染AGR2質(zhì)粒后，可抑制其s127磷酸化水平，促進(jìn)YAP表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示在正常對(duì)照組中，YAP蛋白定位于細(xì)胞核中，加入TNF-α刺激后，YAP蛋白由胞核移位到胞漿，而AGR2抑制YAP蛋白轉(zhuǎn)位至胞漿，從而保持其轉(zhuǎn)錄活性。⑺Western blot結(jié)果顯示AGR2可抑制Hippo通路上游蛋白P-LATS1/2(ser909)，P-MST1/2蛋白表達(dá)，AGR

12、2通過(guò)抑制MST1/2磷酸化，進(jìn)而影響P-LATS1/2(ser909)蛋白表達(dá)，從而活化YAP蛋白。⑻加入YAP抑制劑維替泊芬后，YAP蛋白表達(dá)明顯下降，p-YAP(s127)表達(dá)明顯增加，證實(shí)維替泊芬可有效抑制YAP蛋白表達(dá)，進(jìn)一步檢測(cè)緊密連接及細(xì)胞功能發(fā)現(xiàn)，加入維替泊芬后，AGR2的腸屏障保護(hù)作用被明顯削弱了，無(wú)論是在緊密連接調(diào)控和腸上皮細(xì)胞增殖、重建方面都明顯減弱，證實(shí)了AGR2通過(guò)調(diào)控YAP活性減輕TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障損

13、傷。
　　結(jié)論：①在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)AGR2基因可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞通透性增加，改善緊密連接功能，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，并且這種保護(hù)作用可能通過(guò)抑制NF-κB和MLCK-P-MLC通路活化實(shí)現(xiàn)的。②YAP活化參與AGR2改善TNF-α的腸上皮屏障損傷過(guò)程，AGR2通過(guò)抑制Hippo通路上游MST1/2磷酸化進(jìn)而活化YAP蛋白，AGR2通過(guò)調(diào)控YAP蛋白活性促進(jìn)緊密連接功能、腸上皮細(xì)胞增殖和重建從而改善TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮屏障