GSTM5對TNF-α誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞氧化損傷的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、1、研究背景
　　急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）是1967年首次被報(bào)道的一種以頑固性低氧血和呼吸窘迫為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[1]。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要涉及到過度炎癥反應(yīng)[2]、氧化應(yīng)激[3]、細(xì)胞凋亡[4]、肺泡液清除異常[5]等多種因素。ALI/ARDS尚缺乏有效的治療手段，目前主要是給予保護(hù)性肺通氣以及藥物的保守治療，但病死率仍高[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)ALI/ARDS患者即使生存下來，其后期常伴有呼吸功能

2、差、認(rèn)知功能下降、勞動(dòng)能力喪失等問題[7]。因此對ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制的探索和治療手段的創(chuàng)新仍受到各國學(xué)者的重視。
　　研究認(rèn)為主要源自單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的腫瘤壞死因子α（TNF-α）是ALI/ARDS早期出現(xiàn)的重要炎癥因子，它既能誘發(fā)和放大炎癥的級聯(lián)式反應(yīng)[8-9]，也能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生大量活性氧（ROS）[10]，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞的損傷[11-12]。人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）是重要的肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一，是組

3、成氣道屏障和受環(huán)境刺激首先受累的細(xì)胞。在陳敏慧等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)，H5N1禽流感HA膜蛋白能夠激活16HBE細(xì)胞中的JAK3進(jìn)而抑制cAMP依賴的CFTR氯通道，最終導(dǎo)致ALI。說明氣道上皮的損傷在ALI中扮演了重要角色。因此本研究沿用本實(shí)驗(yàn)室使用的具有代表性的炎癥因子TNF-α刺激16HBE細(xì)胞在體外模擬ALI的炎癥氧化應(yīng)激模型。
　　過度炎癥反應(yīng)所誘發(fā)的氧化應(yīng)激造成肺組織的損傷是ALI的重要發(fā)病機(jī)制之一[14]。在生理狀態(tài)

4、下氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)相互制約、相互依存達(dá)到一種平衡狀態(tài)對機(jī)體無害，而當(dāng)各種理化因素導(dǎo)致氧化增強(qiáng)產(chǎn)生過量的ROS超過抗氧化系統(tǒng)的清理能力時(shí)則造成組織器官氧化損傷。研究表明TNF-α等損傷因素能夠造成呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的ROS[10]，而ROS又能夠激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，氨基末端激酶和核因子kappaB等[15]，促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)[16]，加重肺組織、細(xì)胞損傷[17]。催化ROS產(chǎn)生的重要酶之一是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH

5、）氧化酶，目前發(fā)現(xiàn)的NOX1-5等亞型共同組成了NADPH氧化酶的NOX家族。本實(shí)驗(yàn)組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中，LPS以氣管霧化方式給藥2h后，小鼠肺組織中代表脂質(zhì)過氧化損傷的丙二醛（MDA）濃度較對照組明顯增加，并且NOX氧化酶家族中的NOX1、NOX2等的基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯升高，提示NOX氧化酶家族的某些成員參與了ALI的氧化應(yīng)激過程。
　　谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶mu5（GSTM5

6、）是谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）家族的一員，GST是由兩個(gè)同源二聚體亞基組成的超基因家族，具有多功能。在GST作用下，GSH可與許多親電子物質(zhì)結(jié)合，如GSH與1-氯-2，4-二硝基苯結(jié)合成為1-巰基-2，4-二硝基苯與HCL，使其功能失活，易于通過尿液或膽汁排出體外。該酶還可以清除脂質(zhì)氫過氧化物，2GSH+LOOH?LOH+H2O+GSSG，減輕脂質(zhì)過氧化損傷[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物接觸氧化劑時(shí)體內(nèi)GST高[20]，提示GST家族有重要的

7、介導(dǎo)抗氧化作用。
　　本課題組前期在探討ALI時(shí)氧化酶NOX1基因表達(dá)調(diào)控的過程中，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞受TNF-α刺激后，細(xì)胞核內(nèi)GSTM5表達(dá)水平增高2倍[21]，提示GSTM5參與了ALI時(shí)炎癥誘發(fā)的氧化應(yīng)激，因此調(diào)節(jié)GSTM5活性可能直接或間接影響ALI時(shí)氧化應(yīng)激水平。另有研究報(bào)道，寡聚半乳糖醛酸能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H2O2的生成，同時(shí)誘導(dǎo)抗氧化酶GST的表達(dá)，給予NOX抑制劑能減少寡聚半乳糖醛酸誘導(dǎo)的H2O2生成，同時(shí)GST表達(dá)亦下

8、降[22]。以上均提示GST與NOX酶家族可能存在相互調(diào)節(jié)的機(jī)制。因此，我們推測GSTM5除了作為抗氧化酶直接參與ALI氧化應(yīng)激，其可能調(diào)節(jié)NOX氧化酶家族的表達(dá)，從而影響活性氧的生成，調(diào)控氧化應(yīng)激水平，故而深入研究GSTM5在ALI病理過程中的作用，對制定ALI救治策略具有重要意義。
　　2、研究目的
　　對已經(jīng)構(gòu)建的GSTM5真核表達(dá)載體和siRNA進(jìn)行活性鑒定；探討不同水平GSTM5在TNF-α誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞氧化

9、應(yīng)激損傷病理過程中的作用；明確在TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷的病理過程中GSTM5與NOX氧化酶家族的關(guān)系。
　　3、方法
　　3.1GV230-GSTM5-GFP真核表達(dá)載體和siRNA活性的鑒定
　　根據(jù)GenBank中人GSTM5CDS序列委托公司構(gòu)建GV230-GSTM5-GFP帶有綠色熒光的真核表達(dá)載體，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI酶切、DNA序列測序分析等方法鑒定后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染16HBE

10、細(xì)胞，熒光顯微鏡及WesternBlot檢測GSTM5的表達(dá)。委托公司構(gòu)建GSTM5小干擾RNA序列，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用RT-PCR擴(kuò)增各組GSTM5mRNA，比較不同siRNA對GSTM5轉(zhuǎn)錄抑制程度。
　　3.2GSTM5對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　3.2.1TNF-α刺激16HBE細(xì)胞GSTM5mRNA表達(dá)水平
　　將16HBE細(xì)胞分為空白對照組（不加干預(yù)因素）、TNF-α組（采用不含血清1

11、0ng/mlTNF-α培養(yǎng)基刺激細(xì)胞），24小時(shí)后收集細(xì)胞，RT-PCR檢測GSTM5mRNA表達(dá)。
　　3.2.2GSTM5高表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　（1）細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組、TNF-α組、GSTM5質(zhì)粒組、陰性對照組，GSTM5質(zhì)粒組、陰性對照組分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清的10ng/mlTNF-α培養(yǎng)基刺激24小時(shí)，采集細(xì)胞進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。

12、
　　（2）比色法檢測細(xì)胞丙二醛（MDA）濃度和總抗氧化能力（T-AOC）。
　?。?）3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法檢測細(xì)胞存活率。
　　3.2.3GSTM5低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組為：空白對照組、TNF-α組、siGSTM5組、陰性對照組，siGSTM5組和陰性對照組分別轉(zhuǎn)染GSTM5的siRNA和陰性對照siRNA，轉(zhuǎn)染6

13、小時(shí)后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清10ng/mlTNF-α培養(yǎng)基刺激24小時(shí)，采集細(xì)胞進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法和檢測內(nèi)容同3.2.2。
　　3.3GSTM5對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族的影響
　　3.3.1GSTM5高表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族的影響
　　（1）細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組同3.2.2。
　　（2）RT-PCR檢測NOX家族各亞型的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　?。?）We

14、sternBlot檢測NOX1、NOX2蛋白表達(dá)水平。
　　3.3.2GSTM5低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族的影響細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)分組同3.2.2，實(shí)驗(yàn)方法和檢測內(nèi)容同3.3.1。
　　3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X?s）表示。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。方差齊時(shí)多重比較采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)多重比較采用Dun

15、nett′sT3檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、結(jié)果
　　4.1GV230-GSTM5-GFP真核表達(dá)載體和siRNA活性的鑒定
　　4.1.1質(zhì)粒酶切電泳
　　NheI和BamHI雙酶切含目的基因的GV230-GSTM5-GFP重組質(zhì)粒后得到大小為693bp的酶切產(chǎn)物，與預(yù)期片段大小相同。
　　4.1.2GV230-GSTM5-GFP重組質(zhì)粒測序結(jié)果
　　GV230-GSTM5-G

16、FP重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank公布的GSTM5CDS序列完全一致。
　　4.1.3GV230-GSTM5-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光驗(yàn)證
　　質(zhì)粒轉(zhuǎn)染10小時(shí)后，空白對照組無熒光，GSTM5質(zhì)粒組及陰性對照組見綠色熒光，表明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞并表達(dá)蛋白。
　　4.1.4WesternBlot檢測GV230-GSTM5-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后GSTM5蛋白表達(dá)水平
　　空白對照組和陰性對照組GSTM5蛋白表達(dá)水平無

17、顯著性差異（P>0.05）。GSTM5質(zhì)粒組GSTM5蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.08±0.15比0.20±0.02和0.13±0.01，P<0.05）。
　　4.1.5RT-PCR法篩選GSTM5siRNA序列
　　siGSTM5序列2組GSTM5mRNA表達(dá)水平較空白對照組、siGSTM5序列1組和siGSTM5序列3組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.09±0.08比1.09±0.1

18、5、0.55±0.09和0.41±0.03，P<0.05）。
　　4.2GSTM5對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　4.2.1TNF-α刺激16HBE細(xì)胞GSTM5mRNA表達(dá)水平
　　TNF-α組GSTM5mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.04±0.01比1.84±0.08，P<0.05）。
　　4.2.2GSTM5高表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的脂質(zhì)氧化程度
　

19、　TNF-α組16HBE細(xì)胞MDA水平較空白對照組顯著上調(diào)，與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GSTM5質(zhì)粒組MDA水平較TNF-α組和陰性對照組顯著下調(diào)[（1.53±0.15）nmol/mgpro比（1.97±0.26）nmol/mgpro和（2.08±0.07）nmol/mgpro，P<0.05]，仍高于空白對照組[（1.53±0.15）nmol/mgpro比（0.94±0.17）nmol/mgpro，P<0.05]。<

20、br>　　4.2.3GSTM5高表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的總抗氧化能力
　　TNF-α組T-AOC較空白對照組降低（P<0.05），與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GSTM5質(zhì)粒組T-AOC較空白對照組、TNF-α組和陰性對照組顯著上調(diào)[（3.78±0.42）U/mgpro比（1.93±0.29）U/mg、（1.30±0.14）U/mgpro和（1.28±0.21）U/mgpro，P<0.05]。
　

21、　4.2.4GSTM5高表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的存活率
　　TNF-α組細(xì)胞存活率較空白對照組顯著下調(diào)（P<0.05），與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GSTM5質(zhì)粒組細(xì)胞存活率較TNF-α組、陰性對照組顯著升高（69.15％±9.23%比56.31%±4.33%和56.1%±5.22%，P<0.05），較空白對照組仍有明顯降低（69.15%±9.23%比99.20%±3.79%，P<0.05）。

22、　　4.2.5GSTM5低表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的脂質(zhì)氧化程度
　　TNF-α組16HBE細(xì)胞MDA水平較空白對照組顯著上調(diào)（P<0.05），與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。siGSTM5組MDA水平較空白對照組、TNF-α組和陰性對照組上調(diào)[(3.96±0.32)nmol/mgpro比（1.01±0.13）nmol/mgpro、（2.14±0.11）nmol/mgpro和（2.17±0.21）nmol/

23、mgpro，P<0.05]。
　　4.2.6GSTM5低表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的總抗氧化能力
　　TNF-α組T-AOC較空白對照組降低（P<0.05），與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。siGSTM5組T-AOC較空白對照組、TNF-α組和陰性對照組顯著下降[(0.93±0.14)U/mgpro比（2.35±0.14)U/mgpro、（1.57±0.03）U/mgpro和（1.56±0.11）U/m

24、gpro，P<0.05]。
　　4.2.7GSTM5低表達(dá)時(shí)TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的存活率
　　TNF-α組細(xì)胞存活率較空白對照組顯著下調(diào)（P<0.05），與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。siGSTM5組細(xì)胞存活率較空白對照組、TNF-α組、陰性對照組顯著降低（39.91%±3.43%比99.79%±3.60%、56.20%±5.38%和54.92%±6.94%，P<0.05）。
　　4.3GSTM

25、5對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族的影響
　　4.3.1GSTM5高表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族各亞型mRNA表達(dá)的影響
　　TNF-α組NOX1、NOX2mRNA表達(dá)水平較空白對照組明顯增高（P<0.05）。GSTM5質(zhì)粒組NOX1、NOX2mRNA表達(dá)水平較TNF-α組和陰性對照組顯著降低（0.61±0.08比0.75±0.02和0.78±0.05，0.68±0.06比0.97±0.04和0.95

26、±0.02，P<0.05）。GSTM5質(zhì)粒組16HBE細(xì)胞NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2mRNA表達(dá)水平與TNF-α組、陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.3.2GSTM5高表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)的影響
　　TNF-α組16HBE細(xì)胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)較空白對照組上調(diào)（P<0.05）。GSTM5質(zhì)粒組16HBE細(xì)胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)

27、水平較TNF-α組和陰性對照組降低（0.71±0.10比0.99±0.05和1.00±0.10，0.72±0.11比1.03±0.13和1.04±0.20，皆P<0.05）。
　　4.3.3GSTM5低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX家族各亞型mRNA表達(dá)的影響
　　TNF-α組NOX1、NOX2mRNA表達(dá)水平較空白對照組增高（P<0.05）。siGSTM5組NOX1和NOX2mRNA表達(dá)水平較TNF-α組和陰性對

28、照組升高（0.74±0.04比0.57±0.02和0.59±0.02，0.98±0.08比0.76±0.15和0.79±0.06，P<0.05）。siGSTM5組16HBE細(xì)胞NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2mRNA表達(dá)水平與TNF-α組和陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.3.4GSTM5低表達(dá)對TNF-α誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)的影響
　　TNF-α組16HBE細(xì)

29、胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)（P<0.05）。siGSTM5組16HBE細(xì)胞NOX1、NOX2蛋白表達(dá)水平較TNF-α組和陰性對照組增加（0.61±0.04比0.44±0.06和0.43±0.12，1.28±0.11比0.87±0.16和0.90±0.06，皆P<0.05）。
　　5、結(jié)論
　　繼發(fā)于炎癥反應(yīng)的氧化應(yīng)激是肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞破壞的重要因素，GSTM5具有重要的抗氧化能力，對炎癥誘發(fā)的支氣管上皮細(xì)胞的