FOXO1在TNF-α誘導(dǎo)急性肺損傷中肺泡上皮細(xì)胞凋亡中的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　急性肺損傷（acute lung injury，ALI)是由各種致病因素導(dǎo)致呼吸膜損傷，致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫、透明膜形成，引起進(jìn)行性呼吸窘迫和難以糾正的低氧血癥。ALI繼續(xù)發(fā)展可形成急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS)。
　　ALI發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，過(guò)度放大的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激引起肺泡上皮過(guò)度凋亡所致的呼吸膜損傷是其重要發(fā)病機(jī)制之一。T

2、NF-α是ARDS中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)放大的主要炎癥介質(zhì)，其濃度與病情嚴(yán)重程度、臨床預(yù)后密切相關(guān)。TNF-α在氧化應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展中也起著重要作用，它能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生大量活性氧（Reactive Oxidative Species，ROS）。此外，過(guò)度炎癥反應(yīng)也可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)細(xì)胞內(nèi)源性ROS生成增多，加之ROS清除酶合成不足時(shí)，體內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS水平明顯升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。針對(duì)ARDS的治療，應(yīng)著重抑制過(guò)度炎癥

3、反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有效抗炎與早期免疫調(diào)控同等重要，以避免肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞損傷的加重。
　　在ARDS患者及小鼠模型中均發(fā)現(xiàn)有廣泛的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，是其重要發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)。目前對(duì)ARDS肺泡上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全了解。研究發(fā)現(xiàn)叉頭框（forkhead box, FOX）蛋白家族O1亞型（FOXO1）在TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞凋亡中起重要作用。
　　FOX（Forkhead box）蛋白家族是一類DNA結(jié)合區(qū)

4、具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可直接參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)及協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，于1989年首次在果蠅被發(fā)現(xiàn)。FOXO是FOX家族的一個(gè)亞群，在哺乳動(dòng)物包括FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6四個(gè)亞型，四個(gè)亞家族成員在體內(nèi)各組織均有表達(dá)，但表達(dá)水平各有差異，可能與特定的細(xì)胞功能有關(guān)，F(xiàn)OXO1在脂肪和骨骼肌、肺組織高表達(dá)。FOXOs可直接參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)及協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)

5、胞周期阻滯、DNA損傷/修復(fù)、腫瘤發(fā)生及糖代謝調(diào)節(jié)中起著重要作用。FOXOs蛋白的活性可受磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化調(diào)節(jié)，其中磷酸化是最主要的調(diào)節(jié)方式。FOXOs磷酸化失去活性，并與14-3-3蛋白結(jié)合，二者復(fù)合物從胞核轉(zhuǎn)移至胞漿，在胞漿發(fā)生泛素化而降解。
　　研究發(fā)現(xiàn)FOXOs高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，而當(dāng)FOXOs從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核時(shí)，將促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。FOXOs并非總是引起細(xì)胞損傷，有研究表明FOXO1、FOXO3

6、a、FOXO4缺失，氧自由基生成增加，氧化應(yīng)激水平升高，細(xì)胞損傷增加[18]。表明，F(xiàn)OXOs對(duì)細(xì)胞凋亡或存活的影響并非一成不變，可能受多種因素影響，如細(xì)胞類型、刺激因素、細(xì)胞所處環(huán)境等。我們推測(cè)FOXO1在急性肺損傷TNF-α誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡中有重要作用，深入研究在該病理過(guò)程中的表達(dá)及其生物學(xué)意義，對(duì)制定ALI救治策略具有重要意義。
　　綜上所述，本課題的研究目的如下：
　　1.探討TNF-α中和上調(diào)Foxo1表達(dá)，抑

7、制LPS致小鼠急性肺損傷中的作用及機(jī)制。
　　2.構(gòu)建FOXO1真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并對(duì)其活性進(jìn)行鑒定。
　　3.初步研究FOXO1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制
　　研究方法：
　　1.TNF-α中和上調(diào)Foxo1表達(dá)，抑制LPS致小鼠急性肺損傷的作用及機(jī)制所有小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Controlgroup)、LPS組（LPS group）、TNF-a中和組（TNFR-Fc group）。LPS組、TNF

8、-a中和組氣管霧化LPS溶液5mg/kg，TNF-a中和組于LPS霧化前24小時(shí)腹腔注射依那西普0.4mg/kg。LPS組、TNF-a中和組于LPS溶液霧化后2小時(shí)處死小鼠，收集肺組織。測(cè)量三組小鼠肺濕/干重比；取三組小鼠肺組織常規(guī)固定、脫水、包埋、切片，觀察小鼠肺組織病理并行肺損傷半定量評(píng)分；TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡；RT-PCR檢測(cè)肺組織Foxo1、NF-κB/p65、Bcl-2/Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平；Western Bl

9、ot檢測(cè)肺組織Foxo1、NF-κB/p65磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白比值；檢測(cè)小鼠肺組織丙二醛含量及總抗氧化能力。
　　2.FoxO1綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體的構(gòu)建及鑒定A549細(xì)胞，提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。根據(jù) GenBank提供的人FOXO1基因的序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增FOXO1全長(zhǎng)序列，1％瓊脂糖凝膠電泳，切取含1987bp的目的片段凝膠，膠回收試劑盒回收純化目的片段。
　　用XhoI和Kpn

10、I分別酶切GV230空質(zhì)粒和上述回收、純化的FOXO1目的片段，37℃酶切過(guò)夜,將酶切產(chǎn)物及FOXO1片段經(jīng)1%凝膠電泳后再次切膠回收，獲得帶有黏末端的線性GV230載體和FOXO1全長(zhǎng)CDS，利用T4連接酶將二者16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，含卡那霉素的LB平板篩選后，挑取單克隆菌落，37℃搖菌過(guò)夜，提取質(zhì)粒，并通過(guò)PCR、酶切及測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，熒光顯微鏡及Western blot檢測(cè)FOXO

11、1的表達(dá)。
　　3.FOXO1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制
　　3.1 TNF-α刺激細(xì)胞FOXO1 mRNA及蛋白磷酸化水平將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、TNF-α組，TNF-α組采用不含血清10ng/mL TNF-α培養(yǎng)基刺激細(xì)胞,24小時(shí)后收集細(xì)胞；RT-PCR及WB檢測(cè)FOXO1表達(dá)。
　　3.2 FOXO1高表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制
　　3.2.1 實(shí)驗(yàn)分組細(xì)胞分為對(duì)

12、照組、TNF-a組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組，F(xiàn)OXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染10小時(shí)后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清10ng/mL TNF-α培養(yǎng)基刺激24小時(shí)，收集細(xì)胞或進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)；
　　3.2.2 RT-PCR檢測(cè)FOXO1、NF-ΚB/p65、Bcl-2、Bax、Mn-SOD、CAT mRNA轉(zhuǎn)錄水平
　　3.2.3 Western Blot檢測(cè)FOXO1、NF-ΚB蛋白磷酸化水平及Bc

13、l-2/Bax比值
　　3.2.4 Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率轉(zhuǎn)染FOXO1綠色熒光蛋白質(zhì)粒，增強(qiáng)FOXO1表達(dá)，予10ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24小時(shí)，Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　3.2.5 細(xì)胞活性氧水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染FOXO1綠色熒光蛋白質(zhì)粒，增強(qiáng)FOXO1表達(dá)，予10ng/mL TNF-α刺激細(xì)胞24小時(shí)，采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

14、
　　應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X?S）表示。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。方差齊時(shí)多重比較采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)多重比較采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.探討TNF-α中和上調(diào)Foxo1表達(dá)，抑制LPS致小鼠急性肺損傷中的作用及機(jī)制（重排序號(hào)）
　　1.1

15、 小鼠肺組織濕/干重比LPS組與TNF-α中和組小鼠肺組織濕/干重比高于對(duì)照組，LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　1.2 各組小鼠肺組織病理改變及半定量評(píng)分
　　1.2.1 病理改變小鼠肺組織病理切片行HE染色，對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄，間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)出血、滲出；LPS組小鼠肺泡壁破壞嚴(yán)重，間質(zhì)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管床破壞伴出血；TNF-α中和組損傷程度較LPS組輕。<

16、br>　　1.2.2 小鼠肺損傷半定量評(píng)分LPS組與TNF-α中和組肺損傷半定量評(píng)分高于對(duì)照組，LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　1.3 小鼠肺組織細(xì)胞凋亡LPS組、TNF-α中和組對(duì)照組肺組織細(xì)胞凋亡高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　1.4 小鼠肺組織Foxo1、NF-kB、Bcl-2/Bax mRNA轉(zhuǎn)

17、錄水平
　　1.4.1 肺組織Foxo1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平LPS組與TNF-a中和組Foxo1 mRNA水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TNF-a中和組高于LPS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　1.4.2 肺組織NF-ΚB p65、Bcl-2/BaxmRNA轉(zhuǎn)錄水平LPS組與TNF-α中和組NF-κB P65mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-a中和

18、組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。LPS組與TNF-a中和組Bcl-2/Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； LPS組低于TNF-a中和組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　1.5 小鼠肺組織Foxo1、NF-κB蛋白磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白比值
　　1.5.1 肺組織Foxo1蛋白磷酸化水平LPS組小與TNF-α中組鼠肺組織p-Foxo1/Foxo1高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)

19、計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LPS組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　1.5.2 肺組織NF-κB/p65蛋白磷酸化水平及Bcl-2/Bax比值LPS組與TNF-α中和組p-NF-κB/NF-κB蛋白高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）LPS組與TNF-a中和組Bcl-2/Bax低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組低于TN

20、F-α中和組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　1.6 小鼠肺組織MDA含量LPS組、TNF-α中和組MDA高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組高于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　1.7 小鼠肺組織總抗氧化能力LPS組、TNF-α中和組總抗氧化能力低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；LPS組低于TNF-α中和組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.構(gòu)

21、建及鑒定FOXO1真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體并對(duì)其活性進(jìn)行鑒定
　　2.1 FOXO1 CDS全長(zhǎng)序列PCR擴(kuò)增及鑒定經(jīng)上海英濰捷基公司測(cè)序證實(shí)， PCR產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物與Pubmed上提供的人Foxo1 CDS基因序列一致。
　　2.2 質(zhì)粒酶切電泳未經(jīng)酶切的GV230空質(zhì)粒和GV230-FOXO1重組質(zhì)粒因可能存在超螺旋，開(kāi)環(huán)，線性等不同的構(gòu)象而具有不同的遷移速率，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)大小不同的條帶。經(jīng)XhoⅠ、Kbp I雙酶切

22、后的GV230空質(zhì)粒呈線性，電泳呈一條條帶。GV230-FOXO1重組質(zhì)粒膠經(jīng)XhoⅠ、Kbp I雙酶切后電泳呈兩條帶。
　　2.3 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果取酶切驗(yàn)證正確的GV230-FOXO1重組質(zhì)粒送英濰捷基公司測(cè)序，與NCBI比對(duì)正確。
　　2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染10小時(shí)后，對(duì)照組無(wú)熒光， FOXO1重組質(zhì)粒組及陰性對(duì)照組見(jiàn)明顯綠色熒光，表明質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞并表達(dá)蛋白。
　　2.5 Western blot檢測(cè)

23、FOXO1蛋白表達(dá)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒GV230組FOXO1蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異（P>0.05）；而FOXO1質(zhì)粒組FOXO1蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3. FOXO1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制
　　3.1 TNF-α刺激A549細(xì)胞FOXO1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平對(duì)照組FOXO1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于TNF-α組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　

24、3.2 TNF-α刺激A549細(xì)胞FOXO1蛋白磷酸化水平TNF-α組p-FOXO1/FOXO1高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.3 FOXO1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡影響TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組低于TNF-α組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

25、5)。
　　3.4 FOXO1對(duì)NF-ΚB、Bcl-2/Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組低于TNF-α組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組Bcl-2/Bax mRNA比值低于對(duì)照

26、組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組明顯高于TNF-α組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.5 FOXO1對(duì)NF-κB蛋白磷酸化水平影響TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組p-NF-κB/NF-κB比值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組明顯

27、低于TNF-α組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.6 FOXO1對(duì)Bcl-2/Bax蛋白水平影響TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組Bcl-2/Bax蛋白比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-a組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組高于TNF-α組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.7 FOXO1對(duì)TNF-α誘導(dǎo)A549活性氧

28、水平影響3.8 FOXO1對(duì)CAT、SOD mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組CAT比值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FOXO1質(zhì)粒組明顯高于TNF-α組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。
　　TNF-α組、FOXO1質(zhì)粒組、陰性對(duì)照組SOD比值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TNF-α組與陰性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)