磷脂酰膽堿對(duì)大腸桿菌細(xì)菌壁相關(guān)蛋白和胞外蛋白的影響.pdf

1、為了研究磷脂酰膽堿(PC)在原核生物細(xì)胞膜中的生物學(xué)作用,探討PC對(duì)細(xì)菌膜系統(tǒng)功能的影響,特別是PC的引入對(duì)原核生物細(xì)胞胞壁相關(guān)蛋白以及細(xì)胞外蛋白的表達(dá)和運(yùn)輸?shù)挠绊?以大腸桿菌(Escherichia coli)Top10為研究對(duì)象,使用ptac85表達(dá)質(zhì)粒作為載體,將螺旋菌(Borrelia burgdorferi)pcs基因?qū)隕.coli Top10細(xì)胞中,構(gòu)建了E.coli Top10 pcs+菌株。該菌株在添加有膽堿的培養(yǎng)基中

2、培養(yǎng),經(jīng)IPTG在37℃條件誘導(dǎo)4-8小時(shí),能大量合成PC。以含有ptac85質(zhì)粒的野生型大腸桿菌做對(duì)照,同時(shí)提取兩種細(xì)菌的外膜蛋白,周質(zhì)蛋白和細(xì)胞外蛋白,并利用二維電泳的方法分離蛋白質(zhì)。根據(jù)它們的電泳圖譜,比對(duì)并尋找差異蛋白質(zhì)。然后將明顯差異的蛋白進(jìn)行胰蛋白酶消化,再利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)分析比較。通過MASCOT程序搜尋鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在外膜蛋白的二維電泳凝膠上有三種蛋白差異明顯,分別是OmpW,Pal和Dps。其中,菌株E

3、.coli Top10 pcs+的外膜蛋白OmpW和細(xì)胞質(zhì)蛋白Dps的表達(dá)量較野生型明顯下降,OmpW的表達(dá)量從6.2％降至1.6％,減少約3倍,而Dps四個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)含量從14.67％降至1.29％,總共減少約10倍；另一種外膜脂蛋白Pal則相反,其表達(dá)量從1.5％增加到3.1％,上升了2倍。周質(zhì)蛋白的二維電泳結(jié)果僅有2-3個(gè)蛋白點(diǎn)有區(qū)別,但這些蛋白點(diǎn)含量變化小于2倍。而胞外蛋白的二維電泳結(jié)果表明,E.coli細(xì)胞膜中摻入PC之后,其細(xì)

4、胞外蛋白的種類較野生型明顯減少,但這些蛋白在凝膠上多呈現(xiàn)低豐度。此外,利用Western blotting的方法,使用兩種細(xì)菌的免疫血清,分別對(duì)外膜蛋白、周質(zhì)蛋白和細(xì)胞外蛋白進(jìn)行雜交。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外膜蛋白、細(xì)胞外蛋白分別與Top10/ptac85和Top10 pcs+細(xì)菌免疫兔子后所得的血清多抗雜交時(shí),差異不明顯；而用周質(zhì)蛋白雜交時(shí),同種血清沒有明顯的差異,不同血清之間則差異明顯。二維電泳分析和Western blotting雜交的實(shí)驗(yàn)結(jié)