骨肉瘤干細(xì)胞的分選及惡性表型的鑒定.pdf

1、研究背景:
　　根據(jù)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論，腫瘤實(shí)體由大量的具有異質(zhì)性、異構(gòu)的細(xì)胞群構(gòu)成。腫瘤干細(xì)胞是頂層次結(jié)構(gòu)的亞群，通過對(duì)稱和不對(duì)稱的分裂實(shí)現(xiàn)腫瘤實(shí)體的增加，干細(xì)胞能夠自我更新和產(chǎn)生其余的腫瘤細(xì)胞。與正常人體干細(xì)胞不同的是，腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)散、增殖是失控的。與正常人體干細(xì)胞相同的是，它維持基因組的完整性、具有自我更新能力、多向分化潛能。
　　隨著腫瘤干細(xì)胞理論的提出，生物醫(yī)學(xué)方面的研

2、究人員相繼從白血病、肺癌、腦腫瘤、結(jié)腸腫瘤、肝癌等多個(gè)惡性腫瘤中分選出了腫瘤干細(xì)胞，并在腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)性狀描述上做了大量工作。隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞所具有的獨(dú)特生物學(xué)特性，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、惡性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、耐藥等多個(gè)方面扮演著重要角色。
　　在骨肉瘤的相關(guān)研究中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼從骨肉瘤MG-63、U2OS細(xì)胞株中分選出腫瘤干細(xì)胞，并進(jìn)行了一定程度的生物學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了其CSCs在細(xì)胞表面標(biāo)記、生長(zhǎng)方式、生物學(xué)性能等

3、方面與非CSCs的差異，提示骨肉瘤和其他腫瘤一樣，同樣存在CSCs。然而，作為骨肉瘤家族中惡性程度高（高成瘤、高轉(zhuǎn)移率）的骨肉瘤143-B細(xì)胞株，卻未見相關(guān)報(bào)道。
　　為了進(jìn)一步研究骨肉瘤CSCs的生物學(xué)性能，我們以骨肉瘤143-B細(xì)胞株為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行CSCs的分選，并觀察其生物學(xué)特性。
　　第一部分 有限稀釋法分選骨肉瘤143-B干細(xì)胞
　　目的:
　　探索骨肉瘤干細(xì)胞的分選方法，為進(jìn)一步研究骨肉瘤的生物

4、學(xué)特性打下基礎(chǔ)。
　　方法:
　　購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的143-B細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行軟瓊脂克隆分選、SP分選、有限稀釋法分選，將分選出的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、傳代，同樣傳至第二代后提取RNA并進(jìn)行相對(duì)定量PCR比較其干性因子Nanog、OCT4的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　軟瓊脂克隆法分選出的細(xì)胞在Nanog、 OCT4的表達(dá)上與親代細(xì)胞143-B無顯著差異。有限稀釋法及SP分選法分選出的細(xì)

5、胞在Nanog、OCT4的表達(dá)上高于親代細(xì)胞143-B并差異顯著，而有限稀釋法與SP法分選出的細(xì)胞兩者之間無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　有限稀釋法可有效分選出腫瘤干細(xì)胞，并且在Nanog、OCT4的表達(dá)上與SP分選法分選出的腫瘤干細(xì)胞無顯著差異。
　　第二部分 143-B細(xì)胞株干細(xì)胞的生物學(xué)性能
　　目的:
　　探索骨肉瘤143-B細(xì)胞株干細(xì)胞的生物學(xué)性能，進(jìn)一步了解骨肉瘤并為治療骨肉瘤、提高骨肉瘤患者的生

6、活質(zhì)量、生存時(shí)間提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、成球試驗(yàn)
　　收集143-B、143-L（有限稀釋法所得到的骨肉瘤143-B細(xì)胞株干細(xì)胞）二組細(xì)胞，并計(jì)數(shù)，按照一定濃度接種在無血清軟瓊脂孔板中，觀察細(xì)胞球形成。
　　2、蛋白印跡法(Western-Blot)分析
　　收集143-B、143-L、143-SP（SP分選法分選骨肉瘤143-B細(xì)胞株所得到的腫瘤干細(xì)胞）三組細(xì)胞，并裂解三組細(xì)胞提取總蛋白，

7、以BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定三組細(xì)胞的總蛋白濃度，Western-Blot檢測(cè)三組細(xì)胞中Nanog、OCT4的表達(dá)情況并進(jìn)行比較。
　　3、免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞干性標(biāo)志物表達(dá)
　　將143-B、143-L細(xì)胞以相同濃度接種在爬片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿爬片60％左右面積時(shí)，給予4％多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)Nanog、OCT4在143-B、143-L中的表達(dá)情況并進(jìn)行比較。
　　4、細(xì)胞多向分化潛能潛能的檢測(cè)
　

8、　收集143-B、143-L細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以相同濃度接種在12孔孔板中，分別進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化試驗(yàn)、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，觀察兩組細(xì)胞在成骨分化、成脂、成軟骨分化的能力并進(jìn)行比較。
　　5、細(xì)胞耐藥能力（順鉑、阿霉素）的檢測(cè)
　　收集143-B及143-L細(xì)胞，以相同濃度將細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，次日換液后加入含有不同濃度順鉑的培養(yǎng)基，24小時(shí)后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell countingkit-8，CCK-8)

9、試劑并在酶標(biāo)儀上測(cè)定96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔在450nm處的吸光度(D)值，根據(jù)吸光度(D)值及添加的順鉑濃度繪制耐藥曲線，并在耐藥曲線上標(biāo)出順鉑對(duì)該細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration IC50)。并比較細(xì)胞存活數(shù)量，進(jìn)而比較其對(duì)順鉑的耐藥能力。
　　6、動(dòng)物成瘤試驗(yàn)比較兩組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力
　　將體重、周齡無顯著差異的18只裸鼠隨機(jī)分為6組，143-B及143-L細(xì)胞各按照三

10、個(gè)劑量組(1×106、1×105、1×104)，每個(gè)劑量組皮下注射三只裸鼠，定期測(cè)量瘤體生長(zhǎng)情況及裸鼠體重變化情況，并將兩組細(xì)胞相同劑量進(jìn)行比較。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定試驗(yàn)所得結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
　　結(jié)果:
　　1、143-L具有較143-B更強(qiáng)的成球能力。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、143-L、143-SP較143-B具有更高的Nanog、OCT4蛋

11、白表達(dá)。143-L與143-SP在Nanog、OCT4蛋白表達(dá)上兩者之間無顯著差異。免疫熒光檢測(cè)Nanog、OCT4表達(dá)，143-L較143-B同樣顯著增高。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、在相同的誘導(dǎo)分化條件下，143-L細(xì)胞具有較強(qiáng)的向成骨細(xì)胞分化的能力，143-B細(xì)胞向成骨分化能力較弱;143-L細(xì)胞具有較強(qiáng)的向脂肪細(xì)胞分化能力，143-B不能向脂肪細(xì)胞分化;143-L具有向軟骨細(xì)胞分化的能力，143-B細(xì)胞在誘導(dǎo)階段即不能形

12、成細(xì)胞團(tuán)塊。
　　4、順鉑對(duì)143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.83ug/mL，對(duì)143-L的半數(shù)抑制濃度約為2.51ug/mL。表明143-L較143-B具有更強(qiáng)的對(duì)順鉑耐藥能力。阿霉素對(duì)143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.11 ug/mL，對(duì)143-L的半數(shù)抑制濃度約為0.25ug/mL。表明143-L較143-B具有更強(qiáng)的對(duì)順鉑、阿霉素耐藥能力。
　　5、143-L及143-B兩組細(xì)胞經(jīng)過接種在裸鼠體內(nèi)5周后，143-L細(xì)胞在