牛蹄皮膚附屬物的形態(tài)發(fā)生及其真皮乳頭cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建.pdf

1、形態(tài)發(fā)生是指胚胎細(xì)胞分化成形態(tài)和結(jié)構(gòu)不同的組織和器官的過程。牛蹄皮膚附屬物包括圍繞蹄末端趾骨的角質(zhì)化結(jié)構(gòu)與皮膚，研究牛蹄皮膚附屬物的形態(tài)發(fā)生，不但對于闡明發(fā)育生物學(xué)的熱點(diǎn)問題，器官形態(tài)發(fā)生中上皮一間充質(zhì)的相互作用機(jī)制具有重要的理論意義，其研究成果對于毛囊生物學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)也具有潛在的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)用牛胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料，用石蠟切片，HE染色法系統(tǒng)地研究了牛蹄皮膚附屬物發(fā)育的組織形態(tài)學(xué)；用免疫組化定性檢測了6-catenin在

2、牛蹄皮膚附屬物形態(tài)發(fā)生中的表達(dá)，探討了其表達(dá)的規(guī)律，構(gòu)建牛蹄真皮乳頭cDNA表達(dá)文庫，為研究牛蹄皮膚附屬物的形態(tài)發(fā)生奠定了的研究基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與結(jié)論如下： 1．牛蹄皮膚附屬物形態(tài)發(fā)生的組織形態(tài)學(xué)研究 應(yīng)用HE染色法觀察牛蹄形成過程中真皮、表皮及牛蹄邊緣毛囊的形態(tài)發(fā)生規(guī)律。結(jié)果顯示： (1)真皮乳頭最早出現(xiàn)在胚胎期60天的蹄冠、蹄壁處，蹄壁處的真皮乳頭與表皮互相嵌合，形成真皮小葉，且隨著蹄的發(fā)育，嵌合越來越深；蹄

3、底處的真皮乳頭最早出現(xiàn)在胚胎期70天，胚胎期71-90天，蹄底處真皮乳頭逐漸變粗變深，胚胎期90天左右，真皮乳頭開始出現(xiàn)第一次分叉，分叉之后，其數(shù)目、粗度、長度都增加，胚胎期9卜225天，在經(jīng)過若干次分叉增殖過程之后，蹄底處真皮乳頭數(shù)目、粗度、長度達(dá)到最大；蹄緣處的真皮乳頭最早出現(xiàn)在胚胎期75天左右，在牛蹄發(fā)育過程當(dāng)中，在數(shù)量及大小方面都不及牛蹄其他部位的真皮乳頭。 (2)在胚胎期70天，表皮增厚，向上突起；胚胎期93天，出現(xiàn)了

4、第一個(gè)毛芽，基板出現(xiàn)，上皮、間充質(zhì)細(xì)胞清晰可見；胚胎期106-174，可見毛芽、毛釘；胚胎期210天，形成結(jié)構(gòu)完全的初級毛囊；胚胎期230天毛囊完全成熟。另外，所有的基板、毛芽、毛釘和毛囊都沿遠(yuǎn)離蹄方向呈梯形排列，離蹄部越近，發(fā)育越早，離蹄部越遠(yuǎn)，發(fā)育越晚。 (3)牛蹄皮膚附屬物出現(xiàn)的先后順序?yàn)椋禾愎?、蹄壁真皮乳頭一蹄底真皮乳頭一蹄緣真皮乳頭→毛囊基板→毛芽→毛釘→毛囊；胚胎期191天是一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，此前毛囊、真皮乳頭、表皮持續(xù)發(fā)

5、育，表皮一直增厚，此后毛囊的發(fā)育限制了牛蹄邊緣皮膚的發(fā)育，毛囊和牛蹄真皮乳頭繼續(xù)發(fā)育，而皮膚持續(xù)變薄。 2．β-catenin在牛蹄皮膚附屬物形態(tài)發(fā)生中的表達(dá) 應(yīng)用免疫組化方法定性檢測β-catenin在胎牛蹄邊緣毛囊及真皮、表皮發(fā)育過程中表達(dá)的時(shí)空變化。結(jié)果顯示： (1)β-catenin在牛蹄真皮及表皮形成過程當(dāng)中持續(xù)表達(dá)，在牛蹄所有部位的基底層，胚胎期68-93天，由弱陽性變?yōu)閺?qiáng)陽性，在蹄緣，蹄冠，蹄壁，蹄

6、尖基底層，106-167天，184-225天由中陽性變?yōu)閺?qiáng)陽性；在蹄緣，蹄冠，蹄壁，蹄尖表皮層，胚胎期68-167天，由弱陽性變?yōu)橹嘘栃裕?84-225天，由弱陽性變?yōu)閺?qiáng)陽性；蹄底處真皮乳頭分叉初期基底層為強(qiáng)陽性，分叉中后期為弱陽性；在牛蹄所有真皮乳頭中未見β-catenin表達(dá)：我們還在牛蹄發(fā)育的晚期(胚胎期196天以后)的樣品中發(fā)現(xiàn)了β-catcnin的核內(nèi)表達(dá)，此處β-catenin可能起著促進(jìn)角質(zhì)化細(xì)胞增殖分化的作用；其特有的時(shí)

7、空變化規(guī)律提示β-catenin以其特有表達(dá)規(guī)律在胎牛蹄真皮及表皮形成過程中發(fā)揮著重要作用。 (2)β-catcnin在胎牛蹄邊緣毛囊發(fā)育早期(68-93天)表達(dá)于毛芽、基板、表皮和基底層中，其中在毛芽、基板、基底層中呈強(qiáng)陽性，表皮中呈中陽性；在毛囊發(fā)育中期(94-184天)表達(dá)于毛釘、表皮和基底層中，其中在隆突區(qū)、內(nèi)外根鞘、漏斗部、表皮和基底層呈中陽性；在毛囊發(fā)育晚期(184-225天)只在表皮及基底層有表達(dá)，其中在基底層中呈

8、弱陽性，表皮中呈強(qiáng)陽性。β-catenin表達(dá)的時(shí)空變化規(guī)律提示其在胎牛蹄邊緣毛囊的形態(tài)發(fā)生過程中具有持續(xù)且重要的作用。 (3)β-catcnin在牛蹄真皮層無表達(dá)；在胚胎期68-93天，在牛蹄表皮基底層和牛蹄邊緣表皮基底層中，表達(dá)逐漸增強(qiáng)至強(qiáng)陽性，這說明牛蹄皮膚附屬物形態(tài)發(fā)生過程中β-catcnin的表達(dá)具有一定的同步性。 3．成功構(gòu)建牛蹄真皮乳頭cDNA表達(dá)文庫 構(gòu)建了牛蹄真皮乳頭cDNA表達(dá)文庫，為進(jìn)一步篩