小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達(dá)文庫構(gòu)建及4D8基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、小亞璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)是一種重要的外寄生蟲，在國內(nèi)主要分布于新疆自治區(qū)的半荒漠草原地區(qū)，除可通過叮咬吸血使宿主生產(chǎn)性能降低外，還可作為許多疾病的傳播媒介，是制約流行區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展、危害居民身體健康的重要因素。 本研究采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺cDNA表達(dá)文庫，首先從小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺中提取總RNA，并分離純化mRNA，采用oligo(dT)

2、引物合成雙鏈cDNA，在其兩端加EcoR Ⅰ/HindⅢ定向接頭，將所產(chǎn)生的cDNA分子用Mini Column Fractionation凝膠過濾柱純化后定向克隆到λSCREEN載體的EcoRⅠ和HindⅢ的雙酶切位點(diǎn)之間，體外包裝后得到小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達(dá)文庫。經(jīng)測定，所構(gòu)建的表達(dá)文庫的容量為4.0x105pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫庫容量為8.8x109pfu/mL，重組率為95％，這說明所構(gòu)建小亞璃眼蜱唾液腺cDNA表達(dá)文

3、庫庫容量大、重組率高。 根據(jù)GenBank已公布的邊緣革蜱4D8基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)自小亞璃眼蜱成蜱半飽血雌蜱唾液腺cDNA表達(dá)文庫中，擴(kuò)增獲得了4D8基因；將其連入到pMD-18-T載體，構(gòu)建重組克隆載體pMD-18-Hyaa4D8，測序分析表明，克隆的小亞璃眼蜱4D8基因與GenBank上公布的邊緣革蜱4D8基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為89.2％和96.0％。然后對重組克隆載體pMD-18-Hyaa4D

4、8進(jìn)行雙酶切，獲得帶有粘性末端的4D8基因片段，并將此片段定向亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-Hyaa4D8。將其轉(zhuǎn)化到BL21宿主菌中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表達(dá)產(chǎn)物為分子量為45 ku的融合蛋白，其表達(dá)蛋白濃度為1.24 mg/mL，目的蛋白約占菌體總蛋白的33.0％。采用Western-blotting實(shí)驗(yàn)，分析表明此表達(dá)產(chǎn)物能被小亞璃眼蜱唾液腺免疫兔血