抗RANKL單克隆抗體在大鼠類風濕性關節(jié)炎模型中的應用及RANKL轉錄調控的探索性研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(rheumtoid arthritis,RA)是人類最常見的自身免疫病之一,主要表現為慢性炎性骨病。其基本病理改變是滑膜炎,并可引起原發(fā)和繼發(fā)的全身和/或局部骨代謝變化,包括骨和軟骨的侵蝕、破壞以及系統(tǒng)性骨丟失。盡管目前存在很多抗風濕類藥物,如非甾類抗炎藥(NSAIDs)、四環(huán)素類抗生素、腎上腺糖皮質激素、甲氨蝶呤(MTX)等,其中新近開發(fā)研究的也為數不少,包括TNF—a阻斷劑、特定炎性因子的中和抗體(IL-6、17)以

2、及其他頗有應用前景的靶標分子治療,例如RANK—RANKL信號軸、Wnt信號通路。但是探索類風濕致病機理,并且依此研發(fā)相關新藥仍是醫(yī)學界的熱點。骨組織的正常代謝有賴于破骨細胞(osteoclast)和成骨細胞(osteoblast)的動態(tài)平衡,這也是維持正常的骨重建過程的基礎。成骨細胞與破骨細胞的失衡,即破骨細胞比例增高被認為是類風濕性關節(jié)炎患者骨關節(jié)損害的重要因素。成骨細胞與破骨細胞之間的平衡是受一個重要的信號傳導體系,即RANKL-

3、RANK-OPG信號通路來調控的,OPG作為RANKL的可溶性假受體競爭性抑制其與破骨前體細胞或成熟破骨細胞膜受體RANK結合。三者之間相互作用構成破骨細胞的分化和活性調節(jié)系統(tǒng)。主流觀點認為,破骨細胞的分化和活性受到RANKL/OPG的比例的影響,而RANKL蛋白的比例升高是導致類風濕性關節(jié)炎骨侵蝕的原因,例如幾乎所有的骨吸收調節(jié)因子如IL-1、IL-6、IL—11、IL—17、TNF—α、PTH,都是通過使RANKL表達上調發(fā)揮作用。

4、 圍繞RANKL-RANK-OPG信號傳導系統(tǒng),理論上可以通過以下幾種方法對類風濕性關節(jié)炎進行治療：①過量表達OPG或者應用外源性OPG阻斷RANKL的信號傳導；②阻斷破骨細胞膜RANK蛋白后續(xù)的信號傳導(即破骨細胞內的信號傳導),從而抑制破骨細胞分化；③通過抑制其它因子(如TNF—α和IL-17),抑制RANKL的水平；④應用抗RANKL抗體阻斷其與RANK的結合。目前,由Amgen公司研發(fā)的AMG162(denosumab)[10]

5、,是完全人源化的單克隆抗體,為IgG2免疫球蛋白亞型,對于RANKL分子高親和力和高特異性；藥代動力學與劑量呈非線性關系,與其他完全人源性單克隆抗體相似；治療效果迅速、持久,在抑制破骨細胞骨質吸收上效果可逆；與二膦酸鹽相比,骨密度增加明顯,在絕經后婦女骨質疏松治療中,降低了椎體骨折、非椎體骨折、以及骨盆骨折的風險,觀察到的副作用與安慰劑組無差異,療效甚至療效優(yōu)于OPG和福善美[11]。2010年5月28日,歐盟委員會已批準denosum

6、ab上市,用于絕經后婦女骨質疏松癥以及前列腺癌患者激素抑制相關骨丟失的治療,以降低患者骨折的風險；6月2日,獲美國FDA批準。2010年11月18日,FDA批準denosumab用于預防實體瘤骨轉移患者的骨相關事件。已在歐盟27個成員國以及挪威、冰島、列支敦士登獲得批準,是第一個和唯一獲批的特異性靶向RANK配體的藥物。具有:方便給藥(每六個月給藥一次),效果明顯的優(yōu)勢。最常見不良反應為泌尿道感染,上呼吸道感染,坐骨神經痛,白內障,便秘

7、,皮疹和肢體疼痛。然而,應用單克隆抗體治療疾病這種治療方式仍存在著一些缺點,例如容易發(fā)生免疫反應,不易到達靶細胞,價格昂貴等。為了克服這些缺陷,利用基因工程技術制備的人工抗體開始被開發(fā)并應用。其中具有代表性的單鏈抗體(Single chainantibody,scFv或single chain antigen binding protein,SCA)具有以下優(yōu)點:①分子小,免疫原性低,用于人體不易產生抗異種蛋白反應；②容易進入實體瘤周圍

8、的微循環(huán)；③血循環(huán)和全身廓清快,半衰期短,腎臟蓄積很少；④無Fc段,不易與具有Fc受體的非靶細胞結合；⑤易于基因操作和基因工程大量生產[12、13]。此外,單鏈抗體還可以與毒素、前體藥物轉化酶、放射性同位素、細胞因子等效應分子構建成多種雙功能抗體分子,并且單鏈抗體也是構建雙特異性抗體的理想元件。基于抗RANKL抗體在類風濕性關節(jié)炎治療中的潛在價值,本研究嘗試生產并檢驗抗RANKL單克隆抗體對類風濕性關節(jié)炎的治療作用,并探索新的細胞內效應

9、分子,希望尋找到一個有效的治療類風濕性關節(jié)炎的新藥物。
　　 本研究探索抗RANKL單克隆抗體治療類風濕疾病的作用,基本研究方案為利用基因克隆、雜交瘤技術、親和純化、免疫熒光分析、免疫組化技術、血清和關節(jié)液指標檢測、動物局部情況觀察、大體標本檢測、標本組織學檢測等多項實驗技術,完成以下工作：⑴抗大鼠RANKL的單克隆抗體的制備、發(fā)酵和提純；⑵抗RANKL單克隆抗體對大鼠類風濕模型的治療作用；⑶積極進行細胞基因調控水平的探索性研究

10、。重要研究結果：①單克隆抗RANKL抗體的生產,選取12C12、15C1、15H6三株單抗。②動物模型的建立：佐劑加牛膠原低溫乳化,采用玻璃注射器反復機械運動(最佳次數為推拉注射器1000次)；大鼠尾部多點皮內注射；初次注射后1周加強,初次注射后13～15天發(fā)病,一月左右腫脹消退,關節(jié)變形僵硬。③抗體治療預試驗結果:建模5只Wistar大鼠,12C12單抗治療3只(3mg,單次腹腔注射,PBS為溶劑),其中2只大鼠后肢腫脹消退較早,余1

11、只無明顯差異。未觀察到明顯的毒副作用。不同時間點采血,提取血清,使用ELISA法檢測抗體代謝半衰期。實驗完畢后解剖動物尸體,除四肢關節(jié)結構改變外,未見明顯其他臟器損害。④動物試驗結果:設立5組,正常組、陽性藥物(地塞米松)組、藥物溶劑(PBS)組、小鼠源性IgG組、抗RANKL單克隆抗體干預治療組；從形態(tài)學觀察,治療效果為:陽性藥物組>抗RANKL單克隆抗體干預治療組>藥物溶劑(PBS)組>小鼠源性IgG組。⑤RANKL細胞表達的基因調

12、控,以及在炎癥和調往相關信號通路中作用的探索研究,e2fl,yap,mstl的明顯調控作用,原代OB細胞中結果重復性不好。關鍵數據及其科學意義：⑴通過對RANKL分子相關文獻分析,針對炎性因子結合區(qū)域——膜外片斷合成多肽鏈,并且利用雜交瘤技術,自行研制單克隆抗體,進行體外試驗,選取3株特異性較好的抗體進行預實驗以及動物實驗。⑵就大鼠關節(jié)炎動物模型摸索有效的建模方法,以保證最高的建模成功率；其中包括:完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、牛膠原蛋

13、白的乳化方法、注射方法、注射劑量。⑶動物實驗:①預試驗中使用ELISA法檢測抗體代謝半衰期,誘導RAW263.7細胞分化,少量動物建模治療觀察發(fā)病及治療的時間點；②正式試驗中,嚴格設立對照,對于建模后動物采取陽性藥物、藥物溶劑、小鼠源性IgG、抗RANKL單克隆抗體干預治療,收集一般情況、四肢形態(tài)功能、骨密度、血清檢測炎性因子、組織學切片、免疫熒光檢測,收集相關實驗數據。⑷RANKL分子的細胞內表達調控,以及在炎癥和凋亡相關信號通路中作