抗RANKL單克隆抗體在大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的應(yīng)用及RANKL轉(zhuǎn)錄調(diào)控的探索性研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumtoid arthritis,RA)是人類最常見的自身免疫病之一,主要表現(xiàn)為慢性炎性骨病。其基本病理改變是滑膜炎,并可引起原發(fā)和繼發(fā)的全身和/或局部骨代謝變化,包括骨和軟骨的侵蝕、破壞以及系統(tǒng)性骨丟失。盡管目前存在很多抗風(fēng)濕類藥物,如非甾類抗炎藥(NSAIDs)、四環(huán)素類抗生素、腎上腺糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤(MTX)等,其中新近開發(fā)研究的也為數(shù)不少,包括TNF—a阻斷劑、特定炎性因子的中和抗體(IL-6、17)以

2、及其他頗有應(yīng)用前景的靶標(biāo)分子治療,例如RANK—RANKL信號軸、Wnt信號通路。但是探索類風(fēng)濕致病機(jī)理,并且依此研發(fā)相關(guān)新藥仍是醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)。骨組織的正常代謝有賴于破骨細(xì)胞(osteoclast)和成骨細(xì)胞(osteoblast)的動態(tài)平衡,這也是維持正常的骨重建過程的基礎(chǔ)。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的失衡,即破骨細(xì)胞比例增高被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者骨關(guān)節(jié)損害的重要因素。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡是受一個重要的信號傳導(dǎo)體系,即RANKL-

3、RANK-OPG信號通路來調(diào)控的,OPG作為RANKL的可溶性假受體競爭性抑制其與破骨前體細(xì)胞或成熟破骨細(xì)胞膜受體RANK結(jié)合。三者之間相互作用構(gòu)成破骨細(xì)胞的分化和活性調(diào)節(jié)系統(tǒng)。主流觀點(diǎn)認(rèn)為,破骨細(xì)胞的分化和活性受到RANKL/OPG的比例的影響,而RANKL蛋白的比例升高是導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨侵蝕的原因,例如幾乎所有的骨吸收調(diào)節(jié)因子如IL-1、IL-6、IL—11、IL—17、TNF—α、PTH,都是通過使RANKL表達(dá)上調(diào)發(fā)揮作用。

4、 圍繞RANKL-RANK-OPG信號傳導(dǎo)系統(tǒng),理論上可以通過以下幾種方法對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)行治療：①過量表達(dá)OPG或者應(yīng)用外源性O(shè)PG阻斷RANKL的信號傳導(dǎo)；②阻斷破骨細(xì)胞膜RANK蛋白后續(xù)的信號傳導(dǎo)(即破骨細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)),從而抑制破骨細(xì)胞分化；③通過抑制其它因子(如TNF—α和IL-17),抑制RANKL的水平；④應(yīng)用抗RANKL抗體阻斷其與RANK的結(jié)合。目前,由Amgen公司研發(fā)的AMG162(denosumab)[10]

5、,是完全人源化的單克隆抗體,為IgG2免疫球蛋白亞型,對于RANKL分子高親和力和高特異性；藥代動力學(xué)與劑量呈非線性關(guān)系,與其他完全人源性單克隆抗體相似；治療效果迅速、持久,在抑制破骨細(xì)胞骨質(zhì)吸收上效果可逆；與二膦酸鹽相比,骨密度增加明顯,在絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松治療中,降低了椎體骨折、非椎體骨折、以及骨盆骨折的風(fēng)險(xiǎn),觀察到的副作用與安慰劑組無差異,療效甚至療效優(yōu)于OPG和福善美[11]。2010年5月28日,歐盟委員會已批準(zhǔn)denosum

6、ab上市,用于絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥以及前列腺癌患者激素抑制相關(guān)骨丟失的治療,以降低患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)；6月2日,獲美國FDA批準(zhǔn)。2010年11月18日,FDA批準(zhǔn)denosumab用于預(yù)防實(shí)體瘤骨轉(zhuǎn)移患者的骨相關(guān)事件。已在歐盟27個成員國以及挪威、冰島、列支敦士登獲得批準(zhǔn),是第一個和唯一獲批的特異性靶向RANK配體的藥物。具有:方便給藥(每六個月給藥一次),效果明顯的優(yōu)勢。最常見不良反應(yīng)為泌尿道感染,上呼吸道感染,坐骨神經(jīng)痛,白內(nèi)障,便秘

7、,皮疹和肢體疼痛。然而,應(yīng)用單克隆抗體治療疾病這種治療方式仍存在著一些缺點(diǎn),例如容易發(fā)生免疫反應(yīng),不易到達(dá)靶細(xì)胞,價(jià)格昂貴等。為了克服這些缺陷,利用基因工程技術(shù)制備的人工抗體開始被開發(fā)并應(yīng)用。其中具有代表性的單鏈抗體(Single chainantibody,scFv或single chain antigen binding protein,SCA)具有以下優(yōu)點(diǎn):①分子小,免疫原性低,用于人體不易產(chǎn)生抗異種蛋白反應(yīng)；②容易進(jìn)入實(shí)體瘤周圍

8、的微循環(huán)；③血循環(huán)和全身廓清快,半衰期短,腎臟蓄積很少；④無Fc段,不易與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合；⑤易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)[12、13]。此外,單鏈抗體還可以與毒素、前體藥物轉(zhuǎn)化酶、放射性同位素、細(xì)胞因子等效應(yīng)分子構(gòu)建成多種雙功能抗體分子,并且單鏈抗體也是構(gòu)建雙特異性抗體的理想元件?；诳筊ANKL抗體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的潛在價(jià)值,本研究嘗試生產(chǎn)并檢驗(yàn)抗RANKL單克隆抗體對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用,并探索新的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)

9、分子,希望尋找到一個有效的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新藥物。
　　 本研究探索抗RANKL單克隆抗體治療類風(fēng)濕疾病的作用,基本研究方案為利用基因克隆、雜交瘤技術(shù)、親和純化、免疫熒光分析、免疫組化技術(shù)、血清和關(guān)節(jié)液指標(biāo)檢測、動物局部情況觀察、大體標(biāo)本檢測、標(biāo)本組織學(xué)檢測等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù),完成以下工作：⑴抗大鼠RANKL的單克隆抗體的制備、發(fā)酵和提純；⑵抗RANKL單克隆抗體對大鼠類風(fēng)濕模型的治療作用；⑶積極進(jìn)行細(xì)胞基因調(diào)控水平的探索性研究

10、。重要研究結(jié)果：①單克隆抗RANKL抗體的生產(chǎn),選取12C12、15C1、15H6三株單抗。②動物模型的建立：佐劑加牛膠原低溫乳化,采用玻璃注射器反復(fù)機(jī)械運(yùn)動(最佳次數(shù)為推拉注射器1000次)；大鼠尾部多點(diǎn)皮內(nèi)注射；初次注射后1周加強(qiáng),初次注射后13～15天發(fā)病,一月左右腫脹消退,關(guān)節(jié)變形僵硬。③抗體治療預(yù)試驗(yàn)結(jié)果:建模5只Wistar大鼠,12C12單抗治療3只(3mg,單次腹腔注射,PBS為溶劑),其中2只大鼠后肢腫脹消退較早,余1

11、只無明顯差異。未觀察到明顯的毒副作用。不同時(shí)間點(diǎn)采血,提取血清,使用ELISA法檢測抗體代謝半衰期。實(shí)驗(yàn)完畢后解剖動物尸體,除四肢關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變外,未見明顯其他臟器損害。④動物試驗(yàn)結(jié)果:設(shè)立5組,正常組、陽性藥物(地塞米松)組、藥物溶劑(PBS)組、小鼠源性IgG組、抗RANKL單克隆抗體干預(yù)治療組；從形態(tài)學(xué)觀察,治療效果為:陽性藥物組>抗RANKL單克隆抗體干預(yù)治療組>藥物溶劑(PBS)組>小鼠源性IgG組。⑤RANKL細(xì)胞表達(dá)的基因調(diào)

12、控,以及在炎癥和調(diào)往相關(guān)信號通路中作用的探索研究,e2fl,yap,mstl的明顯調(diào)控作用,原代OB細(xì)胞中結(jié)果重復(fù)性不好。關(guān)鍵數(shù)據(jù)及其科學(xué)意義：⑴通過對RANKL分子相關(guān)文獻(xiàn)分析,針對炎性因子結(jié)合區(qū)域——膜外片斷合成多肽鏈,并且利用雜交瘤技術(shù),自行研制單克隆抗體,進(jìn)行體外試驗(yàn),選取3株特異性較好的抗體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以及動物實(shí)驗(yàn)。⑵就大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型摸索有效的建模方法,以保證最高的建模成功率；其中包括:完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、牛膠原蛋

13、白的乳化方法、注射方法、注射劑量。⑶動物實(shí)驗(yàn):①預(yù)試驗(yàn)中使用ELISA法檢測抗體代謝半衰期,誘導(dǎo)RAW263.7細(xì)胞分化,少量動物建模治療觀察發(fā)病及治療的時(shí)間點(diǎn)；②正式試驗(yàn)中,嚴(yán)格設(shè)立對照,對于建模后動物采取陽性藥物、藥物溶劑、小鼠源性IgG、抗RANKL單克隆抗體干預(yù)治療,收集一般情況、四肢形態(tài)功能、骨密度、血清檢測炎性因子、組織學(xué)切片、免疫熒光檢測,收集相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。⑷RANKL分子的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)調(diào)控,以及在炎癥和凋亡相關(guān)信號通路中作