機(jī)械牽張對(duì)氣道黏膜上皮細(xì)胞黏蛋白表達(dá)的影響及其信號(hào)通路研究.pdf

1、目的：分別觀察呼吸機(jī)機(jī)械通氣、機(jī)械牽張對(duì)兔氣道黏膜和人氣道黏膜上皮細(xì)胞(HBE16)黏蛋白(MUC)5AC表達(dá)的影響，并對(duì)其信號(hào)通路機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法：日本大耳兔隨機(jī)分為對(duì)照組、機(jī)械通氣1、3、6、12和24h組以及2、5和10cmH2O呼氣末正壓(PEEP)組。取支氣管肺泡灌洗液(BALF)，用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)BALF中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8、MUC5AC蛋白和mRNA的水平，

2、計(jì)數(shù)BALF中多型核粒細(xì)胞，底物檢測(cè)法測(cè)定中性粒細(xì)胞彈力酶(NE)活性。
　　 人氣道黏膜上皮細(xì)胞(HBE16)體外培養(yǎng)，采用小型生物撞擊機(jī)給予機(jī)械牽張刺激，各組培養(yǎng)細(xì)胞依施加條件不同而分為對(duì)照、牽張、牽張+釓、牽張+硝苯吡啶、牽張+低分子量肝素、牽張+MARCKS效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(ED)鎖核酸(LNA)以及牽張+MARCKS的ED無(wú)關(guān)對(duì)照LNA序列共7組，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)牽張前后胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度的變化，激光共聚焦顯微鏡觀察

3、胞內(nèi)游離Ca2+分布的情況，并分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫熒光法觀察與胞吐相關(guān)的突觸相關(guān)膜蛋白SNAP23以及黏蛋白(MUC)5AC mRNA和蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC5AC分泌。
　　 再將構(gòu)建的人氣道黏膜上皮細(xì)胞牽張模型，分別給予絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的三條主要通路抑制劑：JNK抑制劑(SP600125)、p38蛋白激酶抑制劑(SB203580)

4、及ERK1/2抑制劑(U0126)(濃度均為30μmol/L)，并設(shè)未進(jìn)行機(jī)械牽張的對(duì)照組和單純機(jī)械牽張組。分別采用RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)MUC5AC mRNA表達(dá)和蛋白分泌量。
　　 結(jié)果：機(jī)械通氣能顯著增強(qiáng)MUC5AC的分泌(P<0.05)。通氣3hTNF-α表達(dá)至峰值，隨后逐漸下降(P<0.05)。通氣6h IL-8表達(dá)至峰值，隨后逐漸下降(P<0.05)。通氣12h后多型核粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞彈力酶活性顯著升高

5、，24h后回降(P<0.05)。隨著PEEP的增加，TNF-α、IL-8、MUC5ACmRNA的表達(dá)和蛋白含量、多型核粒細(xì)胞數(shù)和NE活性均隨之升高(P<0.05)。
　　 機(jī)械牽張能顯著升高人氣道黏膜上皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度(P<0.01)；同時(shí)能顯著升高人氣道黏膜上皮細(xì)胞中SNAP23和MUC5AC表達(dá)，顯著提升細(xì)胞培養(yǎng)上清中MUC5AC分泌(P<0.05)；釓、硝苯吡啶、MARCKS的ED-LNA均能抑制機(jī)械牽張對(duì)SNAP2

6、3表達(dá)和MUC5AC表達(dá)、分泌的提升作用(均P<0.05)；而低分子量肝素未能顯著降低SNAP23表達(dá)和MUC5AC表達(dá)、分泌(P>0.05)。U0126和SB203580能抑制牽張所致MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)增加(均P<0.01)。
　　 結(jié)論：機(jī)械通氣和牽張能促進(jìn)氣道黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC mRNA的表達(dá)和MUC5AC的分泌，其機(jī)制可能與機(jī)械通氣和牽張引發(fā)的炎癥反應(yīng)、張力敏感性陽(yáng)離子通道、Ca2+內(nèi)流、MARCKS