生物素-蛋白連接酶(BirA酶)的基因克隆、原核表達和活性鑒定.pdf

1、由于 BirA 酶生物素化的能力，其作為一種重要的試劑已廣泛用于蛋白質(zhì)分子之間相互作用的研究，特別是細胞表面受體-配體相互作用的研究。
　　 目的：構(gòu)建生物素－蛋白連接酶(BirA酶)基因的表達載體, 并在大腸桿菌 BL21 (DE3)中表達具有生物學活性的BirA酶。
　　 方法：用PCR法擴增BirA酶基因。將PCR產(chǎn)物克隆入 pET32a 中構(gòu)建BirA酶－Trx融合蛋白基因的重組表達載體 pET32a–BirA。

2、經(jīng)測序驗證后, 在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達, 通過 SDS-PAGE 電泳初步檢測，篩選高表達菌株。對高表達菌株進行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵表達，表達產(chǎn)物采用金屬螯和柱進行純化。以帶有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide，BSP)的VR111-BSP蛋白為底物, 用ELISA鑒定表達產(chǎn)物的生物素化活性，并研究了BirA酶生物學活性。
　　 結(jié)果：構(gòu)建了 pET32a–BirA 原核表達質(zhì)粒, 并在大腸

3、桿菌BL21 (DE3)中誘導表達分子量為51779的BirA酶－Trx融合蛋白。表達菌株在30升發(fā)酵罐上建立了高密度發(fā)酵工藝，發(fā)酵密度達到了80 g濕菌體/L發(fā)酵液，BirA酶表達量為2.62×107 U/g濕菌體。表達產(chǎn)物經(jīng)金屬螯和柱純化后, 得到N端帶有Trx標簽的BirA 酶蛋白，純度大于90％。EL ISA的結(jié)果顯示, 表達產(chǎn)物能使底物VR111-BSP蛋白生物素化。并得到了BirA酶的米氏常數(shù)Km（19.4 μM/min）和