噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的構(gòu)建及疾病相關(guān)標(biāo)記物納米抗體的鑒定.pdf

1、駱駝體內(nèi)存在天然的重鏈抗體，克隆其可變區(qū)得到的最小功能性抗原結(jié)合片段，稱為納米抗體。納米抗體具有親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易表達(dá)、組織穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。作為一種新型抗體，納米抗體在基礎(chǔ)研究、疾病診斷和治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。各類展示技術(shù)的引入使得納米抗體的篩選制備變得更加便捷和高效。其中，噬菌體展示技術(shù)是最為常用的方法。此外，在納米抗體制備過程中，文庫(kù)的類型較為多樣，文庫(kù)的質(zhì)量也直接影響納米抗體制備的結(jié)果。
　　借助本課題組成熟的噬

2、菌體展示納米抗體技術(shù)平臺(tái)，本論文系統(tǒng)地構(gòu)建了免疫、天然和合成文庫(kù)三種類型的抗體庫(kù)篩選鑒定納米抗體。(1)首先，通過周期性地駱駝免疫，本論文構(gòu)建了ApoB-100傾向性的納米抗體免疫文庫(kù);通過采取24只未經(jīng)免疫抗原的駱駝的外周血和另一只未免疫駱駝的脾臟并提取總RNA進(jìn)行VHH基因擴(kuò)增，本課題構(gòu)建出庫(kù)容達(dá)6.86×1011，VHH基因多樣性豐富的天然文庫(kù);(2)其次，以納米抗體保守框架cAbBCII10為骨架并借助新穎的三聯(lián)體密碼子盒技術(shù)，

3、利用搭橋PCR技術(shù)成功構(gòu)建了CDR3氨基酸隨機(jī)化，庫(kù)容較大的合成文庫(kù)。(3)接著，利用噬菌體表面展示技術(shù)，本研究成功從免疫文庫(kù)篩選獲得ApoB-100特異性納米抗體;從天然文庫(kù)獲得PCT、NGAL、CD47和HER3特異性的納米抗體，并對(duì)anti-PCT納米抗體進(jìn)行耐熱性研究和檢測(cè)功能性驗(yàn)證;從合成文庫(kù)獲得PA、NGAL、CD47和HER3特異性納米抗體，并以anti-PA納米抗體為代表，比較了其與免疫庫(kù)來源的anti-PA納米抗體的抗

4、原反應(yīng)活性和耐熱性。更為重要的是，本論文成功建立起新型的基于納米抗體的血清中PA含量測(cè)定的ELISA方法。最后，研究中還分析了三種文庫(kù)來源的anti-HER3納米抗體的親和力，為將來選擇不同類型的文庫(kù)進(jìn)行納米抗體的篩選提供了一定的依據(jù)。本研究中構(gòu)建的三種文庫(kù)，尤其是天然和合成文庫(kù)，將成為納米抗體篩選的巨大文庫(kù)資源，具有重要的應(yīng)用潛力和價(jià)值。同時(shí)，鑒定獲得的各種抗原特異性納米抗體也將成為實(shí)際應(yīng)用中的有力抗體工具，可以用于診斷試劑盒研發(fā)、免