以gbss、ssⅢ和ssⅡ為靶標的RNAi載體構建及轉基因馬鈴薯植株的獲得.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L)是淀粉生產的重要原料，其淀粉具有優(yōu)良的特性，廣泛應用于工業(yè)、食品及化工行業(yè)。但在大多數(shù)應用領域中，一般要求淀粉具有較低的糊化溫度和較弱的凝沉性，因而淀粉的糊化和凝沉(老化)特性成為其應用的重要參考指標，而這兩種性質主要與直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長以及淀粉的結構有關。因此，培育具有較低糊化溫度和優(yōu)良凝沉特性的品種，對于提高馬鈴薯淀粉的應用范圍和促進產業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。 隨

2、著人們對淀粉生物合成途徑相關酶生化代謝途徑及分子機理研究的不斷深入，使得應用基因工程技術調控淀粉合成過程中相關酶基因的表達，從而使得降低淀粉糊化溫度和提高凍融穩(wěn)定性成為可能。為此，本研究開展了以RNAi技術對馬鈴薯塊莖內源gbss、ssⅢ和ssⅡ基因進行同時干擾，期望通過改變淀粉合成相關酶的活性，進而改變塊莖中積累的淀粉分子組成，獲得糊化溫度低且凍融穩(wěn)定性更好的加工型馬鈴薯品種。經過研究，已取得了如下結果： (1)應用blast

3、及分子生物學軟件DNAstar對gbss、ssⅡ和ssⅢ基因的cDNA序列同源性進行分析比較，分別從gbss、ssⅢ和ssⅡ基因cDNA片段ORF中篩選出了1～261、2 164～2 407、161～441之間的序列片段作為靶標；采用一步PCR法將靶標基因片段進行融合，得到了大小為785 bp的gbss、ssⅡ和ssⅢ三個基因片段的融合基因。 (2)為便于構建RNAi載體，分別以LS-8質粒(含gbss基因5′側翼序列)、LS-

4、4質粒(含patatin啟動子序列)為模板，亞克隆了馬鈴薯塊莖顆粒結合型淀粉合成酶gbss基因5′側翼序列及馬鈴薯patatin啟動子，并在這兩個啟動子5′和3′加入了Sac Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位點。 (3)分別構建了以gbss基因5′側翼序列和patatin組織特異性啟動子驅動的含有“正向gbs3s2融合片段-pdk內含子-反向gbs3s2融合片段”的植物表達載體pART-GF、pART-PF，并將其成功導入根癌農桿菌L

5、BA4404。 (4)選用馬鈴薯“NHD3”、“NF”和“NC”的莖段作為外植體材料，在MS培養(yǎng)基基本成分的基礎上，對生長激素的濃度和配比進行了優(yōu)化，篩選出有利于受體材料高效再生的培養(yǎng)基配方，其中有利于莖段愈傷誘導的培養(yǎng)基為：MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA(NHD3)；MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA(NC)；MS0+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/NAA(NF)。初