黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶淀粉樣纖維化過(guò)程的抑制作用研究.pdf

1、蛋白的聚集會(huì)導(dǎo)致蛋白空間構(gòu)型發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失正常的生物學(xué)功能，聚集形成的纖維體會(huì)沉積在細(xì)胞中，引起細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致組織器官發(fā)生病變，引發(fā)各種疾病，如老年癡呆癥、Ⅱ型糖尿病、帕金森綜合癥、阿爾茲海默癥等。研究藥物分子對(duì)蛋白淀粉樣纖維化過(guò)程的抑制作用，對(duì)疾病的預(yù)防和治療以及新藥的開(kāi)發(fā)研究具有重要意義。研究表明，天然的酚類(lèi)化合物具有潛在的抑制蛋白纖維化的作用。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在自然界的天然酚類(lèi)物質(zhì)，但目前關(guān)于此類(lèi)化合

2、物對(duì)蛋白聚集抑制作用的研究主要集中于兒茶酚類(lèi)黃酮化合物的研究。溶菌酶是第一種作為疾病標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，是己知能夠形成淀粉樣纖維的球形蛋白經(jīng)典模型，因此，本研究選擇了18種結(jié)構(gòu)不同的非兒茶酚類(lèi)黃酮，以雞蛋清溶菌酶為體外研究模型，通過(guò)條件的考察，建立了溶菌酶聚集纖維化研究模型，在建立的模型的基礎(chǔ)上，利用8-苯胺基-1-奈磺酸（ANS）、硫黃素T(ThT)、剛果紅探針技術(shù)，圓二色譜（CD），透射電鏡等研究了上述黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶纖維化過(guò)程中疏

3、水區(qū)暴露、β片層折疊增加過(guò)程的抑制作用；通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)上述黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶聚集的抑制作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，所獲結(jié)果對(duì)于我們探究黃酮類(lèi)化合物蛋白聚集抑制劑的篩選和分子機(jī)理探討提供了有益的參考和依據(jù)。具體內(nèi)容如下：
　　1.溶菌酶自聚集纖維化過(guò)程體系的構(gòu)建及表征
　　以ThT為熒光探針，考察了不同pH、溫度、有機(jī)溶劑濃度以及放置時(shí)間對(duì)溶菌酶聚集情況的影響，確定了溶菌酶自聚集纖維化過(guò)程研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究表明?0μM

4、雞蛋清溶菌酶在含0.5％的DMSO pH2.0的甘氨酸-HCl緩沖溶液中，恒溫溫度65℃下，放置16天，可以完成自聚集，成長(zhǎng)為淀粉樣纖維，生長(zhǎng)曲線呈S型，成長(zhǎng)過(guò)程是一個(gè)成核—纖維延長(zhǎng)—纖維成熟的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在確定的條件下，通過(guò)ANS熒光探針?lè)ā偣t紫外探針?lè)?、CD光譜以及TEM檢測(cè)了溶菌酶纖維化過(guò)程中疏水區(qū)域暴露和β片層折疊結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果顯示隨著溶菌酶纖維化過(guò)程的加劇，其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，α螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣缕瑢诱郫B結(jié)構(gòu)，

5、疏水區(qū)域暴露加劇，由均一的溶液逐漸成長(zhǎng)為長(zhǎng)的絲狀纖維。
　　2.黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶自聚集纖維化過(guò)程的影響研究
　　在相同實(shí)驗(yàn)條件下，將與溶菌酶不同濃度比例（1:1,1:0.5,1:0.2）的黃酮類(lèi)化合物加入溶菌酶樣品中一起孵育，采用ThT、ANS熒光法、剛果紅吸收法、CD、透射電子顯微鏡檢測(cè)黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶聚集的影響。結(jié)果顯示，加入黃酮類(lèi)化合物的溶菌酶溶液，與成熟纖維的ThT熒光強(qiáng)度、ANS熒光強(qiáng)度以及剛果紅吸收強(qiáng)度相

6、比，都有不同程度的降低，降低的程度與加入的黃酮化合物的濃度呈正相關(guān)；CD光譜顯示，加入黃酮類(lèi)化合物后，聚集過(guò)程中β片層結(jié)構(gòu)的吸收逐漸減小，α螺旋結(jié)構(gòu)吸收逐漸增多；TEM形貌觀察顯示，加入黃酮類(lèi)化合物后的溶菌酶纖維變短，變細(xì)。在這18種黃酮類(lèi)化合物中；葛根素、柚皮素、槐角苷、槲皮素，水飛薊賓、柚皮苷、白楊素、黃芩苷、黃芩素、木犀草素都顯示出了較強(qiáng)的抑制溶菌酶聚集纖維化的作用，在1:1濃度比例下，對(duì)溶菌酶聚集過(guò)程的疏水區(qū)暴露及β片層增多的抑

7、制率均達(dá)到70%以上，顯示了較強(qiáng)的抑制作用。
　　3.分子對(duì)接法研究黃酮類(lèi)化合物與溶菌酶的相互作用
　　由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶聚集的抑制作用主要發(fā)生在溶菌酶纖維化形成的前期，意味著黃酮類(lèi)化合物對(duì)溶菌酶的聚集抑制主要來(lái)源于黃酮類(lèi)化合物與溶菌酶單體之間的相互作用，因此，我們以2LYZ的三維空間結(jié)構(gòu)作為模型蛋白，用Autodock4.0軟件對(duì)溶菌酶與黃酮類(lèi)化合物分子進(jìn)行分子對(duì)接，分子對(duì)接的研究結(jié)果顯示，黃酮類(lèi)化