乙肝核心抗原原核表達與純化的初步研究.pdf

1、目的： 構(gòu)建pET28a(+)-HBcAg重組基因的原核表達載體，將重組子在E.coliRosetta(DE3)中進行誘導(dǎo)表達，利用鎳螯合瓊脂糖凝膠柱分離純化HBcAg蛋白，為進一步研究其蛋白活性、試劑盒的研發(fā)以及乙型肝炎核心抗原作為載體呈遞外源表位及其疫苗的研制奠定一定的基礎(chǔ)。 方法： 1、pET28a(+)-HBcAg重組基因原核表達載體的構(gòu)建、表達采用PCR方法，以含HBcAg基因的克隆質(zhì)粒為模板，擴增基因

2、HBcAg并將其克隆入原核表達載體質(zhì)粒pET28a(+)中，構(gòu)建成表達載體pET28a(+)-HBcAg，菌落PCR、限制性內(nèi)切酶雙酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒的構(gòu)建是否正確。將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21和E.coliRosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達，通過SDS-PAGE和免疫印跡分析表達產(chǎn)物。 2、以鎳瓊脂糖凝膠FF進行全菌中HBcAg蛋白的純化將主要以包涵體形式表達的蛋白質(zhì)的全菌，用Buffer溶解，超聲破碎后

3、以鎳瓊脂糖凝膠FF純化產(chǎn)物HBcAg，通過SDS-PAGE和免疫印跡進行分析純化產(chǎn)物。 結(jié)果： 1、原核表達載體的構(gòu)建和表達菌落PCR、雙酶切鑒定分析以及測序結(jié)果分析表明原核表達載體pET28a(+)-HBcAg與設(shè)計相符；工程菌Rosetta(DE3)/pET28(+)-HBcAg誘導(dǎo)表達后在分子量為21KDa處可產(chǎn)生特異的表達條帶，并能夠被抗鼠IgG單克隆抗體所識別，蛋白分子量大小與預(yù)期相一致。 2、表達細菌

4、中的HBcAg蛋白的純化全菌蛋白經(jīng)以鎳瓊脂糖凝膠FF柱，電泳檢測HBcAg蛋白純化度，純化度約達90％；抗原性經(jīng)免疫印跡分析表達產(chǎn)物表明，其免疫原性尚佳。 結(jié)論： 本課題中，我們通過基因過程的方法，成功的構(gòu)建了原核表達載體pET28(+)-HBcAg，鎳瓊脂糖凝膠FF柱分離純化得到了較純的HBcAg蛋白，為進一步研究HBcAg蛋白的結(jié)構(gòu)，試劑盒的開發(fā)及其蛋白活性及乙型肝炎核心抗原作為載體呈遞外源表位及其疫苗的研制奠定一定