釀酒酵母Cdc48蛋白的原核表達(dá)、純化及電鏡結(jié)構(gòu)初步研究.pdf

1、釀酒酵母可作為一種重要的模式生物來研究真核生物。酵母的基因與很多疾病的基因有很高的同源性。研究這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，有助于對(duì)這些疾病加深了解，從而使這些疾病的診斷和治療水平得以提高。
　　Cdc48是Ⅱ型AAA ATPase蛋白家族的成員，Cdc48在哺乳動(dòng)物中的同族體稱為p97或VCP。Cdc48具有ATPase活性、泛素連接及與多種輔助因子結(jié)合等生化特性。Cdc48在許多細(xì)胞事件中發(fā)揮功能并且與人類許多惡性疾病的發(fā)生有關(guān)。通過對(duì)C

2、dc48蛋白的同源體p97的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)研究證明，其結(jié)構(gòu)包含由氨基末端N端結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)ATP酶結(jié)構(gòu)域（D1和D2）和羧基末端非結(jié)構(gòu)化的C端。Cdc48由六個(gè)單體形成六聚體，圍繞一個(gè)中央軸向孔，孔有一個(gè)Zn2+。
　　p97的結(jié)構(gòu)研究要么是對(duì)其部分結(jié)構(gòu)域的解析，要么得到的是缺少N端和C端部分氨基酸的結(jié)構(gòu)。而對(duì)Cdc48蛋白的研究主要集中在它的功能方面,對(duì)它的結(jié)構(gòu)的研究并不多，這對(duì)研究Cdc48功能的研究造成了一定的限制。
　　通過

3、實(shí)驗(yàn)，將得到的含有釀酒酵母 cdc48全長基因的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中，成功表達(dá)Cdc48蛋白。優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)的條件,在16℃，添加0.05 mM IPTG過夜誘導(dǎo)的條件下，成功高效表達(dá)了可溶性的Cdc48蛋白。
　　優(yōu)化了鎳離子金屬螯合磁珠親和純化的條件。在鎳離子金屬螯合磁珠親和純化的Buffer中使用1 M NaCl。在裂解Buffer，添加20 mM咪唑及0.6％ Triton X-100，孵育后進(jìn)行純化，以提高Cdc48蛋白

4、與磁珠的結(jié)合量，并減少雜蛋白與鎳離子磁珠的非特異性結(jié)合。在清洗過程中，首先用含有50 mM咪唑及0.6%的Triton X-100的Cdc48清洗Buffer A大量清洗，然后用含有100 mM咪唑但不含有Triton X-100的Cdc48清洗Buffer B少量清洗。在洗脫過程中，使用含有500 mM咪唑的洗脫 Buffer，小體積多次洗脫，讓 Cdc48蛋白用較少的洗脫Buffer便可洗脫干凈。
　　通過鎳離子螯合磁珠親和純

5、化、DEAE陰離子交換層析、Superose6凝膠過濾層析三步純化，得到了純度較高的Cdc48蛋白。
　　通過電鏡觀察，用較少的樣品和染液快速觀察Cdc48蛋白的結(jié)構(gòu)圖像特征，獲得了低分辨的Cdc48蛋白六聚體的環(huán)狀模型，確定了Cdc48蛋白的純化質(zhì)量還是不錯(cuò)的，蛋白狀態(tài)也比較均一。
　　本課題的研究為進(jìn)行高分辨率的冷凍三維電鏡分析的第一步，也是關(guān)鍵的一步。這對(duì)全面解析Cdc48蛋白的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，確立其處于不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)