大鼠2-AAF-PH模型中庫普弗細胞促卵圓細胞擴增及肝臟保護作用的實驗研究.pdf

1、第一部分:
　　 目的:觀察脂質體包裹氯膦酸二鈉剔除大鼠肝臟庫普弗細胞的作用，以及剔除后庫普弗細胞再生恢復的情況。
　　 方法:正常大鼠隨機分為實驗組和對照組。實驗組大鼠給予脂質體包裹的氯膦酸二鈉，對照組給予等量生理鹽水。RT-PCR檢測庫普弗細胞受體KCR mRNA的表達情況；尾靜脈注射印度墨汁判斷庫普弗細胞吞噬碳素顆粒的情況；組化檢測庫普弗細胞標記物ED1和ED2的表達情況。給藥后不同時間點處死大鼠，動態(tài)觀察ED1、

2、ED2陽性細胞數(shù)目變化。
　　 結果:給藥后2天RT-PCR檢測不到肝臟庫普弗細胞受體mRNA的表達，肝竇內吞噬碳素顆粒的庫普弗細胞消失，ED1、ED2陽性細胞基本消失。給藥后第8天ED1陽性細胞開始明顯增多，至第11天其數(shù)目基本恢復正常。ED2陽性細胞至第11天開始增加，但平均每中倍視野仍僅有（4.8±1.7）個細胞，明顯少于對照組的（17.7±2.1）個細胞，差異具有統(tǒng)計學意義（P﹤0.01）。
　　 結論:靜脈單次

3、注射合適劑量的脂質體包裹氯膦酸二鈉能在2天內有效剔除肝臟庫普弗細胞，剔除效果可持續(xù)至少一周時間。成功建立剔除肝臟庫普弗細胞的動物模型，為我們后續(xù)研究庫普弗細胞功能的實驗奠定了基礎。
　　 第二部分：
　　 目的:庫普弗細胞可以通過釋放多種因子在肝細胞介導的肝再生過程中扮演重要角色。前期研究顯示，誘導卵圓細胞增殖的動物模型中也發(fā)現(xiàn)庫普弗細胞大量存在于門脈區(qū)，因此我們推測庫普弗細胞在卵圓細胞介導的肝再生中也可能起重要作用。本

4、部分通過建立大鼠2-AAF/PH卵圓細胞介導肝再生模型，觀察剔除庫普弗細胞后卵圓細胞擴增的變化，旨在探討庫普弗細胞對卵圓細胞增殖擴增的作用。
　　 方法:將2-AAF/PH卵圓細胞增殖模型大鼠隨機分為庫普弗細胞剔除組和非剔除對照組。術前48小時剔除庫普弗細胞，對照組給予等劑量生理鹽水，術后不同時間點處死大鼠。計算殘肝重量/體重比值評估殘肝再生程度；免疫組化檢測EpCAM、PCK和PCNA并計數(shù)陽性細胞數(shù)目，計算門脈區(qū)周圍嗜堿性新

5、生小管樣反應面積，以評估卵圓細胞增殖程度；免疫熒光雙標檢測EpCAM和PCNA共表達情況檢測卵圓細胞增殖率；Caspase-3組化和TUNEL染色檢測卵圓細胞凋亡個數(shù)；實時熒光定量PCR檢測肝臟白蛋白和甲胎蛋白mRNA表達水平；分離2-AAF/PH大鼠術后肝臟庫普弗細胞，收集無血清培養(yǎng)液上清；免疫酶聯(lián)吸附試驗檢測細胞培養(yǎng)液上清及肝臟組織勻漿中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）表達水平；Western Blot檢

6、測肝臟STAT3和磷酸化STAT3的表達情況；EpCAM和α-SMA免疫熒光雙標檢測卵圓細胞和肝星狀細胞相互關系。
　　 結果:剔除庫普弗細胞后2-AAF/PH大鼠殘肝再生受抑，術后第9天卵圓細胞數(shù)目及門脈區(qū)增殖小管樣面積也顯著減少。同時，剔除組大鼠卵圓細胞分化也受抑制或被延遲。術后第9天對照組大鼠可見大量新生小肝細胞，而剔除組大鼠卵圓細胞仍然處于幼稚形態(tài)。并且，對照組肝臟甲胎蛋白mRNA水平下調，白蛋白mRNA水平明顯上調。說

7、明剔除庫普弗細胞后卵圓細胞增殖分化均受抑制。然而，卵圓細胞增殖率及凋亡細胞數(shù)在兩組間沒有顯著差異；剔除庫普弗細胞也不會影響肝星狀細胞和卵圓細胞的相互作用，以及肝細胞生長因子（HGF）的合成釋放。提示剔除庫普弗細胞并不影響卵圓細胞進入細胞周期后的增殖動力學，而可能在更早的階段產生影響。分離2-AAF/PH大鼠術后6小時的肝臟庫普弗細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6濃度顯著增高,這兩個經(jīng)典的炎癥因子是啟動肝再生的重要因子，主要由庫普弗細胞

8、分泌,而剔除庫普弗細胞可以導致術后急性期肝臟的TNF-α和IL-6水平下降，同時引起下游核因子STAT3磷酸化水平下降。
　　 結論:2-AAF/PH模型中庫普弗細胞可能通過分泌重要增殖刺激因子TNF-α和IL-6，并激活下游STAT3磷酸化，在術后急性期對卵圓細胞的激活起到重要促進作用。
　　 第三部分：
　　 目的：庫普弗細胞是炎癥介質的主要來源，參與肝損傷過程，但同時也能發(fā)揮肝臟保護作用。2-AAF/PH激

9、活卵圓細胞增殖的模型中，庫普弗細胞是表現(xiàn)出介導肝損傷的作用還是肝保護的作用是本部分研究的重點。
　　 方法：將2-AAF/PH卵圓細胞增殖模型大鼠隨機分為庫普弗細胞剔除組和非剔除對照組。記錄并統(tǒng)計大鼠術后生存率；留取術后不同時間點肝臟標本及血清樣本，檢測兩組血清丙氨酸轉氨酶（ALT）和天門冬氨酸轉氨酶（AST）濃度變化；肝臟切片HE染色觀察術后肝臟損傷情況；Caspase-3免疫組化及TUNEL染色檢測肝細胞凋亡情況；ELISA

10、檢測肝臟IL-10蛋白水平變化。
　　 結果：對照組注射生理鹽水的所有2-AAF/PH模型大鼠均良好存活，而剔除庫普弗細胞的大鼠死亡率增高，僅有少數(shù)能存活到術后第9天(P<0.01)；肝組織切片HE染色顯示剔除庫普弗細胞后，肝臟可見明顯肝細胞變性及片狀壞死灶；剔除庫普弗細胞的大鼠肝切除術后AST和ALT水平較對照組升高更明顯，且恢復正常較緩慢，至術后第9天仍高于對照組。剔除組術后24小時caspase-3陽性及TUNEL陽性凋亡