CX-GJIC對大鼠體內(nèi)肝卵圓細(xì)胞的調(diào)控及機制.pdf

1、燒傷后肝功能障礙頗為常見，肝功能損害的程度與燒傷嚴(yán)重程度相關(guān)。肝再生是肝損傷后存活肝細(xì)胞增殖修復(fù)重建損傷肝臟的一個重要病理過程。但是在肝細(xì)胞增殖能力受損時，肝干細(xì)胞成為重建肝臟的主要細(xì)胞來源，肝干細(xì)胞以其高增殖雙向分化潛能，在肝損傷重建過程中展示了誘人的前景。隨著干細(xì)胞研究的興起，人們發(fā)現(xiàn)肝干細(xì)胞與肝臟腫瘤發(fā)生關(guān)系也非常密切，因此對于肝干細(xì)胞研究的首要任務(wù)是闡明其調(diào)控機制。 縫隙連接蛋白(Connexin，CX)介導(dǎo)的縫隙連接細(xì)

2、胞間通訊(gap junctionintercellular Commtlnication，GJIC)是細(xì)胞間最重要的信息交流形式，調(diào)節(jié)組織的損傷及修復(fù)過程。與生長、分化密切相關(guān)的小分子物質(zhì)(<1000Da)可以通過GJ從一個細(xì)胞至另一個細(xì)胞，從而影響組織細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等重要生物學(xué)過程。最新研究表明干細(xì)胞增殖、分化與CX的表達(dá)密切關(guān)聯(lián)，受CX及其介導(dǎo)的GJIC影響。因此，CX／GJIC可能是干細(xì)胞增殖、分化過程中的關(guān)鍵靶點

3、。 卵圓細(xì)胞(hepatic oval cells，HOC)是肝干細(xì)胞的子代細(xì)胞，目前對肝干細(xì)胞的調(diào)控研究多針對于HOC，大多探討細(xì)胞因子的影響。現(xiàn)已證實HOC表達(dá)CX43蛋白，但是CX／GJ工C對HOC增殖、分化的調(diào)控作用如何?其機制如何?目前所知甚少。 為探討上述問題，本課題通過建立大鼠HOC增殖動物模型，從以下幾個層次逐步深入的對上述問題進行研究： 第一部分大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型肝臟的CX／GJIC表達(dá)

4、 目的：研究大鼠肝卵圓細(xì)胞增殖模型肝臟CX／GJIC的表達(dá)規(guī)律。 方法：雄性Wi star大鼠36只，隨機分成Cotltro1組(n=6)和2-AAF／PH組(n=30)。 2-AAF／PH組按改良Solt-Farber法建模：2-AAF每日按20mg／kg劑量灌喂，連續(xù)4天，第5日不灌喂，行2／3肝切除，術(shù)后次日按20mg／kg／d劑量繼續(xù)灌喂5日。術(shù)后2-AAF／PH組隨機在4h、4d、8d、12d、16d相應(yīng)的

5、時間點取材(n=6)，Control組作正常對照。采用組織病理技術(shù)觀察肝組織的形態(tài)學(xué)變化、免疫組化方法計數(shù)HOC及CX32、CX43的定位分布，IL／DT技術(shù)分析GJIC，蛋白印跡檢~CX43的水平，RT-PCR檢測CX32、CX43的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： HOC的增殖特點：Control組未見增生反應(yīng)。2-AAF／PH組在肝切后4h無明顯增殖反應(yīng)；4d匯管區(qū)有增生反應(yīng)，8d至高峰、12d向肝實質(zhì)內(nèi)穿插生長的HOC已連

6、接成片、16d明顯減少，增生細(xì)胞體積較小、細(xì)胞核呈卵圓形、胞質(zhì)較少(為肝細(xì)胞的1／3～1／5)、核／漿比例較大、略嗜堿性、大小及分布不均勻、呈簇狀分布，從匯管區(qū)向肝小葉中央浸潤，免疫組化顯示增生細(xì)胞對AFP，CKl9，OV-6，CX43染色陽性，具有雙向表型細(xì)胞標(biāo)志特點(肝細(xì)胞表型：AFP，膽管細(xì)胞表型：CK19)，符合HOC的特征。4h～16d增殖HOC數(shù)分別為：2.50±1.20、8.20±1.50、26.53±1.56、16.60

7、±2.30、11.10±3.20個。 肝臟GJIC的變化：Control組染料擴散距離250±5μm，約相當(dāng)于10個肝細(xì)胞直徑。2-AAF／PH組4h～16d各時點染料擴散距離低于Control組(P<0.01)分別為：84.5±3.4、60.6±3.3、108.6±4.2、150.6±2.6、199.6±3.7μm：結(jié)論： 1、采用Solt-Farber方法成功建立YHOC增殖動物模型，本實驗顯示該模型具有動

8、物耐受性好、易復(fù)制、HOC增殖情況理想等優(yōu)點； 2、大鼠2-AAF／PH模型肝臟GJIC先抑制后逐漸恢復(fù)，與HOC增殖趨勢相反，GJIC下調(diào)HOC增殖，OJIC恢復(fù)HOC增殖減少，結(jié)果提示肝臟GJIC的下調(diào)可能啟動了HOC增殖； 3、在2-AAF／PH后肝臟CX呈時空特異性表達(dá)：CX32表達(dá)于肝細(xì)胞膜，先下調(diào)后逐漸恢復(fù)，表達(dá)趨勢與GJIC相同；CX43表達(dá)于HOC，先升高后逐漸恢復(fù)，表達(dá)趨勢與GJIc相反。HOC

9、的增殖、分化與CX／GJIC密切關(guān)聯(lián)，提示通過調(diào)節(jié)肝臟CX的表達(dá)，改變GJIC可能會影響goc的增殖、分化過程。 第二部分CX／OJIC對大鼠體內(nèi)肝卵圓細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控 目的：探討CX／GJIC對大鼠體內(nèi)肝卵圓細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控。 方法：雄性WiWistar大鼠60只，隨機分成PB組(n=30)、PNS組(n=30)。PB組：大鼠予以800 ppm PB飲水7天，第8天按2-從F／PH組建模，800 ppm

10、 PB飲水持續(xù)至實驗結(jié)束；PNS組：大鼠按2-AAF／PH組建模時(即第一次AAF灌胃時)予以PNS 25mg／kg／d腹腔內(nèi)注射，持續(xù)實驗結(jié)束。各組隨機在術(shù)后：4h、4d、8d、12d、16d相應(yīng)的時間點取材。觀察指標(biāo)同第一部分。 結(jié)果： Hoe的增殖特點：PB、PNS組大鼠在4h無明顯HOC增殖。PB組4h～16d各時點Hoe數(shù)為：4.51±3.24、14.20±3.57、38.24±5.20、28.65±4

11、.87、18.58±3.54個，與2-AAF／PH組比較4d～16d明顯增加(P<0.01)，HOe增殖早、峰值高、持續(xù)時間長的特點；PNS組各時點HOC分別為：2.70±1.50、6.30±1.30、21.67±3.23、22.8±2.98、6.82±1.02個，增殖峰在8d、12d。與2-AAF／PH組比較在12d HOC數(shù)高于2-AAF／PH組，在4d、8d、16d HOC數(shù)明顯減少(P<0.05)，表現(xiàn)為HOC增殖峰低、滯后、持

12、續(xù)時間長的特點。 肝臟GJIC的變化：PB、PNS組大鼠肝臟GJIC表達(dá)呈先下調(diào)后逐漸恢復(fù)趨勢。PB組4h～16d各時點染料擴散距離與2-AAF／PH組規(guī)律相同，但低于2-AAF／PH組(P<0.05～p<0.01)，分別為：74.3±3.4、38.4±2.9、88.5±4.3、126.7±4.5,175.9±4.8 μm。PNS組4h～16d各時點染料擴散距離與2-AAF／PH組規(guī)律相同，但高于2-AAF／PH組(P<0

13、.01)，分別為：132.8±5.2、78.2±2.3、118．5±3.5、183．7±3.6、225.3±3.2 μ m。結(jié)論： 1、采用PB改變大鼠2-AAF／PH模型肝臟的CX32、CX43時空表達(dá)模式，可下調(diào)肝臟的GJIC，減少HOC與偶聯(lián)細(xì)胞間GJIC，解除HOC生長抑制，促進HOC的增殖，表現(xiàn)為HOC增殖早、增殖水平高； 2、PNS可以增加大鼠2-AAF／PH模型肝臟的CX32表達(dá)、滯后CX43的表達(dá)，上調(diào)

14、肝臟的GJIC，增加HOC與偶聯(lián)細(xì)胞間GJIC，精確動員HOC重建肝臟，使HOC增殖峰低、滯后、持續(xù)時間長； 3、通過下調(diào)大鼠2-AAF／PH模型肝臟的GJIC，使HOC增殖早、增殖水平高；上調(diào)GJIC使HOC增殖峰低、滯后、持續(xù)時間長，證明了CX／GJIC可以調(diào)節(jié)體內(nèi)HOC的增殖、分化過程。 第三部分 CX／GJIC對大鼠體內(nèi)肝卵圓細(xì)胞調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究 目的：探討CX／GJIC對大鼠體內(nèi)肝卵圓細(xì)胞調(diào)控的可

15、能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 方法：雄性Wistar大鼠96只，隨機分成Control組(n=6)，2-AAF／PH組(n=30)，PB組(n=30)，PNS組(n=30)。各組大鼠同上處理。運用免疫組化定位觀察、蛋白印跡半定量分析p-ERK1／2的表達(dá)。 結(jié)果： p-ERK1／2的免疫組化觀察：Control組大鼠肝臟p-ERK1／2免疫組化顯示淡的胞質(zhì)染色，多分布于終末肝靜脈周圍肝細(xì)胞；各組大鼠2-AAF／PH后4h

16、 染色強度輕度增加，多在Ⅰ、Ⅱ帶肝細(xì)胞的胞膜和胞核。4d染色多表達(dá)于匯管區(qū)HOC細(xì)胞核，在8d、12d匯管區(qū)HOC細(xì)胞核p-ERKI/2染色增強。16d染色減弱。 　　 結(jié)論： 　 在大鼠2-AAF/PH模型肝臟p-ERKI/2主要表達(dá)于HOC，其活化與GJIC的抑制密切相關(guān)。下調(diào)2-AAF/PH肝臟的GJIC能增加ERKl/2的活化；上調(diào)2-AAF/PH肝臟的GJIC能抑制p-ERK的表達(dá)。結(jié)果提示C

17、X/GJIC可能通過影響ERKI/2的活化，調(diào)節(jié)HOC的增殖、分化過程。 綜合本研究資料表明，大鼠2-AAF/PH模型肝臟CX32、CX43蛋白的表達(dá)重塑，能在轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后及通道的門控多水平抑制GJIC，由于Cx通道的高選擇轉(zhuǎn)運特性和GJIC的抑制，改變了肝組織細(xì)胞間物質(zhì)信息交流，影響肝臟對生長、增殖信號的整合，動員HOC活化。下調(diào)2-AAF/PH模型肝臟的GJIC抑制使P-ERKl/2表達(dá)增多，促進HOC的增殖；上調(diào)2-