小鼠肝臟卵圓細(xì)胞增殖和凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：2-AAF+2/3PH誘導(dǎo)成體小鼠卵圓細(xì)胞模型的建立及卵圓細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)成體小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖模型，及穩(wěn)定高效對(duì)卵圓細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)的方法，觀察卵圓細(xì)胞的增殖能力，生物學(xué)特性，對(duì)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并證明其分化潛能。
　　 方法：利用喂飼2-乙酰氨基芴(2-AAF)＋2/3肝大部分切除方法誘導(dǎo)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖。經(jīng)

2、改良的經(jīng)門(mén)靜脈灌注膠原酶消化，等密度Percoll離心法分離卵圓細(xì)胞，并在體外進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色觀察卵圓細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，免疫熒光、RT-PCR和糖原染色對(duì)分離培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞表型加以鑒定。
　　 結(jié)果：增殖模型中的肝臟組織中可以發(fā)現(xiàn)有明顯的卵圓細(xì)胞增殖，并能夠分離培養(yǎng)出穩(wěn)定傳代的卵圓細(xì)胞。分離并體外培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，呈鋪路石樣，卵圓細(xì)胞體積較小，細(xì)胞胞漿少，體積大小不均一，核漿比例大，

3、為正常肝細(xì)胞的約1/3大小，細(xì)胞直徑為8-10μm。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，免疫熒光、RT-PCR和糖原染色技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞進(jìn)行鑒定，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CK19,PKM2，C-kit,CX32,CX43,AFP,ALB,AML-1等抗原，證實(shí)該細(xì)胞確為卵圓細(xì)胞，該細(xì)胞具有向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化的潛在能力。
　　 結(jié)論：運(yùn)用2-AAF+2/3PH的方法可以穩(wěn)定誘導(dǎo)小鼠卵圓細(xì)胞的增殖，改良的經(jīng)門(mén)靜脈灌注膠原酶消化，等密度Pe

4、rcoll離心法可以高效的分離卵圓細(xì)胞，分離出的卵圓細(xì)胞可以在體外進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。本方法為少數(shù)能夠順利誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)卵圓細(xì)胞增殖活化，并能夠穩(wěn)定分離和培養(yǎng)出卵圓細(xì)胞的方法之一，為在多品系實(shí)驗(yàn)性嚙齒類(lèi)動(dòng)物的肝癌研究奠定研究基礎(chǔ)。
　　 第二部分：小鼠卵圓細(xì)胞Trx2的表達(dá)以及Notch信號(hào)通路在卵圓細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的變化
　　 目的：研究卵圓細(xì)胞硫氧還蛋白2的表達(dá)和Notch信號(hào)通路在卵圓細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，探討卵圓細(xì)胞的抗凋亡以及增

5、殖分化的機(jī)制。
　　 方法：利用喂飼2-乙酰氨基芴(2-AAF)＋2/3肝大部分切除方法誘導(dǎo)小鼠肝臟卵圓細(xì)胞的增殖，建立對(duì)照組，處理組4d，6d，8d時(shí)間點(diǎn)的小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。免疫蛋白印跡，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞的Trx2的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)其凋亡。基因芯片技術(shù)檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：小鼠肝臟卵圓細(xì)胞內(nèi)的Trx2的表達(dá)量明顯升高，處理組6d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量最高，卵圓細(xì)胞的凋亡率