LP-PLA2的原核表達、抗體制備及表位分析.pdf

1、脂蛋白相關磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)屬于ⅦA型磷脂酶A2,它可以預測與冠脈事件有關的動脈粥樣硬化和中風危險。目前,在國內,LP-PLA2臨床診斷試劑主要依賴于從國外進口,所需費用昂貴,限制了該檢測項目在我國的推廣及應用,因此,研發(fā)LP-PLA2體外免疫診斷試劑尤為重要。
　　 目的：本研究旨在獲取人脂蛋白相關磷脂酶A2蛋白,制備相應抗體,同時驗證經

2、生物信息學預測的表位肽的抗原性,為LP-PLA2體外免疫診斷試劑的研發(fā)奠定基礎。
　　 方法：采用Trizol法從分化的THP-1細胞中提取總RNA,經RT-PCR擴增目的片段LP-PLA2;利用分子克隆技術構建原核表達質粒;轉化入大腸桿菌BL21(DE3),優(yōu)化誘導表達條件,進行多步驟純化并除去標簽,獲得目的蛋白,免疫新西蘭大白兔,制備抗LP-PLA2的多克隆抗體;運用多種生物信息學方法對LP-PLA2抗原表位進行預測,并用純

3、化的LP-PLA2多克隆抗體鑒定其抗原性。
　　 結果：
　　 1.成功構建了PET-28a(+)-LP-PLA2,PGEX-4T-2-LP-PLA2,pColdTF-LP-PLA2等重組表達質粒。
　　 2.經IPTG誘導表達后,SDS-PAGE電泳顯示:LP-PLA2在PET-28a(+)-LP-PLA2表達載體中不表達;在PGEX-4T-2-LP-PLA2表達載體中少量表達,且主要以包涵體形式存在;在pCo

4、ld TF-LP-PLA2表達載體中,獲得表達量較高的融合蛋白,主要以上清形式存在。
　　 3.將pCold TF-LP-PLA2誘導表達上清經鎳柱親和層析純化后,獲得TF-LP-PLA2重組蛋白,將該重組蛋白用HRV-3C prolease酶切后,用藍膠分離純化,獲得了純度約為90％、分子量約為45kD的蛋白,與預期相符,且該蛋白能夠被市售的LP-PLA2多克隆抗體識別,證明獲得了純度較高的LP-PLA2目的蛋白。
　　

5、 4.制備了抗LP-PLA2的多克隆抗體,抗體效價＞1:5.12×106,Western blot結果表明,該抗體特異性較高。
　　 5.運用生物信息學軟件綜合分析預測了LP-PLA2的三段表位肽,體外抗原抗體免疫反應實驗證實了三段表位肽均具有良好的抗原性。
　　 結論成功表達并純化獲得了高純度的LP-PLA2蛋白;制備了效價和純度均較高的LP-PLA2多克隆抗體;運用生物信息學分析方法預測了LP-PLA2的三段表位肽