MMP1基因修飾的骨髓間充質干細胞對肝纖維化修復作用的實驗研究.pdf

1、肝纖維化發(fā)病率和死亡率高,是能夠對人類健康造出巨大威脅的一種全球流行的疾病,它的終末階段是肝硬化,肝硬化以假小葉形成和肝功能進行性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn),然而,肝纖維化是一個動態(tài)過程,并對肝細胞損傷有著復雜的調節(jié)機制,大量證據(jù)表明,肝纖維化是一個可逆的疾病,因此,采取有效的治療可以防止甚至逆轉肝纖維化。骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells, BMSCs)由于其多向分化和自我更新的潛能,被認為是一種行之有效的方法,BMS

2、Cs在體外可分化為肝細胞,更有研究證實BMSCs移植到大鼠肝臟后可以轉化為肝樣細胞。然而大量實驗已經證實單獨使用BMSCs作用有限,而基因修飾的BMSCs是提高其治療能力的一種可行的方法,基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組能夠降解細胞外基質(ECM)的酶,它們在正常的生理過程,例如生長、組織重塑、炎癥、血管生成、損傷修復和細胞遷移中起著重要的作用。這其中的基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase1,MMP-1)

3、能夠降解纖維膠原I, II, III, X型,明膠和蛋白聚糖類,在肝臟的基質降解中發(fā)揮著重要的作用。
　　目的:
　　通過將人基質金屬蛋白酶-1(hMMP-1)修飾的BMSCs注入肝纖維化大鼠體內,觀察其可否增強BMSCs對肝纖維化的修復作用。
　　方法:
　　貼壁法培養(yǎng)BMSCs,體外用重組腺病毒Ad-hMMP-1-增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP

4、)轉染大鼠BMSCs,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達,Western blot法檢測各組細胞內hMMP-1蛋白表達情況,細胞增殖-毒性檢測試劑盒Cell Couning Kit-8(CCK-8)法檢測轉染后細胞增殖情況。
　　使用50％四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)+植物油溶液0.3ml/100g皮下注射造肝纖維化模型,10周后驗證肝纖維

5、化模型,測量各組大鼠體重和肝臟重量,下腔靜脈取血檢測肝纖維化指標,蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察病理組織學改變并行病理組織學評分,確認建模成功后,尾靜脈注射轉染后的BMSCs。
　　轉染后3周,處死各組大鼠,酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測血清中hMMP-1表達情況,hMMP-1酶活性熒光定量試劑盒檢測組織中酶活性,測量

6、第3周各組大鼠的體重及大鼠肝臟的重量,下腔靜脈取血檢測肝功及肝纖維化的指標,冰凍切片于熒光顯微鏡下觀察肝臟組織中的綠色熒光的表達情況,通過HE染色觀察病理組織學的改變并行肝臟組織病理組織學評分,糖原染色或者稱為PAS染色法(Periodic Acid-Schiff staining)觀察肝臟組織糖原合成情況,膠原染色或者稱為MASSON染色法(masson staining)觀察膠原合成情況,熒光定量PCR、Westeron blot和

7、肝臟組織免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)檢測MMP-1、組織金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP-1)、甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)、白蛋白(Albumin,ALB)、細胞角蛋白-18(Cytokeratin18, CK-18)的基因和蛋白表達情況。
　　結果:
　　BMSCs用貼壁法成功培養(yǎng),在體外

8、成功將重組腺病毒Ad-hMMP-1-eGFP導入大鼠BMSCs中,轉染后對細胞增殖無明顯影響;10周后造模成功,尾靜脈注射后轉染的BMSCs成功在大鼠肝臟定植,行冰凍切片在肝組織中可見GFP標記的細胞,ELISA檢查血清中僅有轉染hMMP-1組有hMMP-1表達,酶活性為1.438×10-3mmol/(g·min);hMMP-1組較肝纖維化對照組體重明顯增加,較空載體組、肝纖維化對照組兩組肝臟重量明顯增加,肝功能較肝纖維化對照組明顯改善