NOX4-自噬途徑介導apelin-13促單核細胞-人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附.pdf

1、目的：Apelin作為APJ受體內(nèi)源性配體，具有促單核細胞-內(nèi)皮細胞粘附等多種生物學效應。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，apelin通過PI3K途徑誘導單核細胞向人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附。本課題擬研究 apelin-13對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中NOX4源ROS和自噬的影響，并在前期研究基礎上進一步探討 apelin-13促單核細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附的機制，為動脈粥樣硬化的治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、Western Blot檢測

2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞NOX4、beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ICAM-1、β-Tublin和β-Actin的表達；
　　2、用DCFH-DA探針檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS的生成，熒光顯微鏡觀察或多功能酶標儀定量檢測；
　　3、mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞，標記及追蹤細胞內(nèi)LC3，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬流；
　　4、Calcein AM標記單核細胞，熒光顯微鏡和多功能酶標儀檢測單核細胞-人臍

3、靜脈內(nèi)皮細胞粘附情況；
　　5、SiRNA沉默人臍靜脈內(nèi)皮細胞的beclin-1和LC3，觀察其對細胞粘附的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時間依賴（0-24h）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS的生成；
　　2、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時間依賴（0-24h）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞NOX4的表達；
　　3、NOX抑制劑DPI和PI3K阻斷劑LY29400

4、2抑制apelin-13誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS的生成；
　　4、Class III PI3K抑制劑3-MA抑制apelin-13（0.1μM，12h）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞ROS水平和NOX4表達的增加；
　　5、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時間依賴（0-24h）誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬標志蛋白beclin1和LC3-II/I的表達增加；
　　6、Apelin-13誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬流增加，

5、加入自噬溶酶體降解阻斷劑羥基氯喹不可抑制apelin-13誘導的自噬流增加；
　　7、ROS清除劑NAC、過氧化氫的酶類清除劑Catalase和NOX抑制劑 DPI抑制了apelin-13誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬標志蛋白 beclin1和LC3-II/I表達的增加；
　　8、ROS清除劑 NAC和過氧化氫的酶類清除劑 Catalase抑制了apelin-13誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬流增加；
　　9、ROS清除劑 NAC

6、、過氧化氫的酶類清除劑 Catalase、NOX抑制劑DPI和ClassⅢ PI3K抑制劑3-MA抑制apelin-13促單核細胞-人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附的作用；
　　10、Beclin1 siRNA和LC3 siRNA抑制apelin-13促單核細胞-人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附；
　　11、自噬誘導劑Rapamycin促進單核細胞-人臍靜脈內(nèi)皮細胞粘附；
　　12、ROS清除劑NAC、過氧化氫的酶類清除劑Catalase、N