NOX4-自噬途徑介導(dǎo)apelin-13促單核細(xì)胞-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附.pdf

1、目的：Apelin作為APJ受體內(nèi)源性配體，具有促單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附等多種生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，apelin通過(guò)PI3K途徑誘導(dǎo)單核細(xì)胞向人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附。本課題擬研究 apelin-13對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中NOX4源ROS和自噬的影響，并在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討 apelin-13促單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、Western Blot檢測(cè)

2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOX4、beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、ICAM-1、β-Tublin和β-Actin的表達(dá)；
　　2、用DCFH-DA探針檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成，熒光顯微鏡觀察或多功能酶標(biāo)儀定量檢測(cè)；
　　3、mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，標(biāo)記及追蹤細(xì)胞內(nèi)LC3，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬流；
　　4、Calcein AM標(biāo)記單核細(xì)胞，熒光顯微鏡和多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)單核細(xì)胞-人臍

3、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附情況；
　　5、SiRNA沉默人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的beclin-1和LC3，觀察其對(duì)細(xì)胞粘附的影響。
　　結(jié)果：
　　1、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時(shí)間依賴（0-24h）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成；
　　2、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時(shí)間依賴（0-24h）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOX4的表達(dá)；
　　3、NOX抑制劑DPI和PI3K阻斷劑LY29400

4、2抑制apelin-13誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成；
　　4、Class III PI3K抑制劑3-MA抑制apelin-13（0.1μM，12h）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平和NOX4表達(dá)的增加；
　　5、Apelin-13濃度依賴（0-1.0μM）和時(shí)間依賴（0-24h）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白beclin1和LC3-II/I的表達(dá)增加；
　　6、Apelin-13誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬流增加，

5、加入自噬溶酶體降解阻斷劑羥基氯喹不可抑制apelin-13誘導(dǎo)的自噬流增加；
　　7、ROS清除劑NAC、過(guò)氧化氫的酶類(lèi)清除劑Catalase和NOX抑制劑 DPI抑制了apelin-13誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白 beclin1和LC3-II/I表達(dá)的增加；
　　8、ROS清除劑 NAC和過(guò)氧化氫的酶類(lèi)清除劑 Catalase抑制了apelin-13誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬流增加；
　　9、ROS清除劑 NAC

6、、過(guò)氧化氫的酶類(lèi)清除劑 Catalase、NOX抑制劑DPI和ClassⅢ PI3K抑制劑3-MA抑制apelin-13促單核細(xì)胞-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附的作用；
　　10、Beclin1 siRNA和LC3 siRNA抑制apelin-13促單核細(xì)胞-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附；
　　11、自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin促進(jìn)單核細(xì)胞-人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附；
　　12、ROS清除劑NAC、過(guò)氧化氫的酶類(lèi)清除劑Catalase、N