XPD對ox-LDL促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　本研究在首先發(fā)現(xiàn)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)表達(dá)剪切修復(fù)基因D(xeroderma pigmentosum D,XPD)的基礎(chǔ)上,以氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型,觀察XPD在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)的表達(dá);同時(shí)沉默內(nèi)皮細(xì)胞XPD基因的表達(dá)后,觀察ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況,探討XPD-siRNA對ox-LDL

2、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,RT-PCR檢測XPD mRNA表達(dá)。
　　2、以氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型,培養(yǎng)基中ox-LDL終濃度分別為50μg/m l、100μg/m l、150μg/m l、200μg/m l,孵育24小時(shí)。通過MTT檢測細(xì)胞活力,篩選ox-LDL最佳作用濃度,建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型。
　　3、用Weste

3、rn Blottig檢測經(jīng)ox-LDL處理的HUVEC中XPD的蛋白表達(dá)變化。
　　4、設(shè)計(jì)并化學(xué)合成3對靶向XPD的siRNA,即XPD-siRNA-1、XPD-siRNA-2、XPD-siRNA-3,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HUVEC。通過Western Blotting檢測XPD蛋白的表達(dá),篩選出最佳干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　5、將最佳干擾序列轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,并經(jīng)最佳濃度的ox-LDL孵育24小時(shí)。將實(shí)驗(yàn)分6組:a.空白對照組;

4、b.陰性對照siRNA組;c. XPD-siRNA組;d. ox-LDL組;e. ox-LDL+陰性對照siRNA組;f. ox-LDL+XPD-siRNA組。
　　6、用MTT法測定各組細(xì)胞的存活率;流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率;提取各組細(xì)胞的蛋白通過Western Blottig檢測XPD、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況;提取各組細(xì)胞的RNA通過RT-PCR檢測XPD、Bcl-2和Bax基因的表達(dá)情況。
　　7、統(tǒng)計(jì)方

5、法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)人剪切修復(fù)基因D(XPD)。
　　2、濃度為50~200μg/ml的ox-LDL作用HUVEC24h,均能破壞其活力與凋亡之間的平衡,其中100μg/ml為最佳作用濃度。
　　2、XPD在經(jīng)不同濃度ox-LDL處理的HUVEC中表達(dá)均增加。
　　3、3對 XPD-

6、siRNA均能有效抑制 HUVEC中 XPD的表達(dá),其中以XPD-siRNA-2沉默效率最高,為(76.15±2.14)％。
　　4、MTT結(jié)果顯示, XPD-siRNA組的細(xì)胞活力較空白對照組增加(140.43±4.26 VS100, p<0.05),ox-LDL+XPD-siRNA組的細(xì)胞活力較ox-LDL+陰性對照siRNA組明顯增加(110.91±3.22 VS70.58±4.67, p<0.05)。
　　5、流式細(xì)

7、胞儀的結(jié)果顯示,XPD-siRNA組的細(xì)胞凋亡率較空白對照組降低(2.0±0.30 VS5.17±0.16, p<0.05), ox-LDL+ XPD-siRNA組的細(xì)胞凋亡率較ox-LDL+陰性對照siRNA組明顯降低(15.26±0.74 VS28.32±0.63, p<0.05)。
　　6、RT-PCR和Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,XPD-siRNA組XPD表達(dá)降低,分別為(0.11±0.01

8、 VS0.32±0.01, p<0.05)和(0.1±0.0.01 VS0.49±0.0.01, p<0.05);Bcl-2表達(dá)增高,分別為(0.35±0.02 VS0.15±0.02, p<0.05)和(0.24±0.0.02 VS0.07±0.02, p<0.05);Bax表達(dá)降低,分別為(0.1±0.01 VS0.53±0.02, p<0.05)和(0.07±0.01 VS0.37±0.02, p<0.05)。
　　7、RT

9、-PCR和Western Blotting結(jié)果還發(fā)現(xiàn),與ox-LDL+陰性對照siRNA組相比,ox-LDL+XPD-siRNA組XPD表達(dá)降低,分別為(0.45±0.02 VS0.65±0.01, p<0.05)和(0.25±0.0.01 VS1.06±0.01, p<0.05);Bcl-2表達(dá)增高,分別為(0.24±0.02 VS0.09±0.06, p<0.05)和(0.15±0.01 VS0.04±0.00, p<0.05);B