ACA對CRM1依賴的出核運輸抑制作用的初步研究.pdf

1、乙酰氧基胡椒酚乙酸酯(1’-acetoxychavicol acetates，ACA)是一種從高良姜中提取的天然小分子化合物，具有抗腫瘤，抗過敏，抗真菌，保胃，抗氧化和黃嘌呤氧化酶抑制劑等多種生物學功能。但是ACA的藥物作用機理的相關研究還停留于初級階段；我們的研究發(fā)現(xiàn)ACA可能是通過抑制CRM1依賴的蛋白出核運輸而實現(xiàn)其生物學功能的。 我們選取了ZR-75-30，SK-BR-3，MDA-MB-453，MCF-7，Bcap-37

2、五種乳腺癌細胞系，分別檢測了ACA對他們的毒性作用，發(fā)現(xiàn)ACA在10μmol/L濃度水平即對這些腫瘤細胞生長具有一定的抑制作用。我們還對乳腺細胞HBL-100進行了檢測，發(fā)現(xiàn)同樣的濃度水平下沒有明顯的毒性作用。實驗結(jié)果說明了ACA可以有效地抑制乳腺癌細胞的生長。 為了研究ACA對蛋白出核運輸?shù)挠绊?，我們在對融合酵母Schizosaccharomyces pombe(S.Pombe)的研究中使用了包含SV40T抗原NLS和Rev蛋

3、白NES序列的GST-GFP融合蛋白(GST-NLS-GFP-NES)，從而可以很方便地跟蹤CRMl依賴的蛋白出核運輸。實驗結(jié)果顯示ACA可以有效的阻斷CRMl依賴的NES信號蛋白的出核，使相關的蛋白大量聚集在細胞核中。 初步判定ACA對CRM1正常功能的抑制作用后，我們預測ACA可能是通過與CRM1直接結(jié)合而影響CRM1的生物學功能，于是進行了ACA對LMB的競爭性分析。LMB是一種已經(jīng)確定的CRM1的抑制劑，可以直接與CRM

4、1蛋白相結(jié)合并改變CRM1的構(gòu)象進而影響其正常功能。在競爭性分析中我們發(fā)現(xiàn)ACA在較高濃度時可以與LMB競爭CRM1上的結(jié)合位點。 為了對ACA與CRMl相互作用作更深一步的研究，我們構(gòu)建了CRMl真核表達載體pcDNA-CRMl-HA表達CRMl全長，以及將CRMl分為三個片段分別進行表達的原核表達載體pGEX-4T2-CRMl-I(1-1029)，pGEX-4T2-CRMl-Ⅱ(985-2199)，pGEX-4T2-CRMl

5、-Ⅲ(2110-3213)。 我們利用pcDNA-CRMl-HA進行體外翻譯得到的CRMl蛋白，分析ACA對CRMl在天然聚丙烯酰胺凝膠上遷移率的影響。實驗結(jié)果表明高濃度的ACA可以使CRMl的遷移率明顯提高；這說明高濃度ACA的存在使CRMl的構(gòu)象發(fā)生了變化，起到與LMB相似的效果。 通過以上實驗，我們對ACA對CRM1依賴性的蛋白出核運輸?shù)囊种谱饔眉捌渥饔脵C制進行了具有啟發(fā)性的初步研究。先前國內(nèi)外相關研究中普遍認為A