心肌缺血再灌注中Rho-kinase對PI3-kinase-Akt的作用及紫檀芪的干預(yù)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 心肌缺血再灌注和缺血預(yù)適應(yīng)中Rho-kinase對PI3-kinase/Akt的作用
　　目的：
　　本部分研究擬建立大鼠心肌缺血再灌注和缺血預(yù)適應(yīng)模型，應(yīng)用藥物fasudil抑制Rho-kinase活性，通過檢測心肌梗死面積、心肌細胞的凋亡、Rho-kinase和Akt的活性變化來闡明Rho-kinase在心臟I/R和IPC中的作用機制。
　　方法：
　　1、健康

2、雌性Wistar大鼠隨機分為4組:(1)sham group對照組:假手術(shù)組（12只）;(2)I/R組(12只):大鼠心肌缺血再灌注模型組;(3)I/R+fasudil組（12只）:建立大鼠心肌缺血再灌注模型前給予Rho-kinase抑制劑法舒地爾fasudil組;(4)IPC組（12只）:大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)組。
　　2、制備大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　3、制備大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型。
　　4、檢測心肌梗死面積:采用

3、伊文思藍染色鑒別心肌缺血危險區(qū)(AAR)和非缺血區(qū)，硝基藍四氮唑染色鑒別梗死心肌和非梗死心肌。
　　5、TUNEL檢測心肌細胞凋亡:利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標記技術(shù)(TUNEL)試劑盒檢測各組大鼠心肌細胞的凋亡。
　　6、免疫組化法標記p-Akt。
　　7、Western blot檢測p-Akt和Rho-kinase的活性變化。Rho-kinase的活性通過檢測其特異性底物肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT-1)

4、的磷酸化水平來表示。
　　結(jié)果：
　　1、在心肌缺血再灌注（I/R）組中p-MYPT-1（磷酸化的MYPT-1）大量表達，但在心肌缺血預(yù)適應(yīng)組中， p-MYPT-1表達降低，p-Akt表達顯著增高，與I/R組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Rho-kinase在I/R中活性增加，而心肌缺血預(yù)適應(yīng)和fasudil可抑制Rho-kinase活性。
　　2、抑制Rho-kinase的活性可減少I/R所致的心肌細胞

5、凋亡:I/R過程中應(yīng)用fasudil抑制Rho-kinase活性可減少心肌細胞凋亡率，而對大鼠進行心肌缺血預(yù)適應(yīng)也可通過抑制Rho-kinase的活性降低心肌細胞凋亡。
　　3、抑制Rho-kinase活性可減少心肌梗死面積:在I/R組中，AAR和心肌梗死面積分別是（52.62±2.73％）和（59.89±3.83％）。
　　4、抑制Rho-kinase可增加Akt活性:p-Akt在I/R組中表達被抑制，而在IPC組和I/R

6、+fasudil組中大量表達。在I/R中應(yīng)用Rho-kinase抑制劑fasudil后，p-Akt表達增加。
　　結(jié)論：
　　1、心肌缺血再灌注損傷中，Rho-kinase活性顯著增加，造成心肌細胞凋亡，心肌梗死面積加大，心肌損傷加重。
　　2、抑制Rho-kinase活性可減少心肌缺血再灌注中心肌細胞凋亡率和心肌梗死面積，降低心肌細胞的損傷。
　　3、Rho-kinase可通過調(diào)節(jié)p-Akt水平影響心肌細胞凋亡

7、。
　　4、心肌缺血預(yù)適應(yīng)可減少心肌細胞凋亡和心肌梗死面積。
　　5、心肌缺血預(yù)適應(yīng)中Rho-kinase活性降低，進而減輕心肌損傷，這一過程可能是通過PI3-kinase/Akt的活化介導(dǎo)的，本研究為臨床上冠心病的治療提供新的理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。
　　第二部分 紫檀芪預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的作用研究
　　目的：
　　本部分研究擬建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，進行紫檀芪預(yù)處理，探討紫檀芪對心肌

8、缺血再灌注損傷的作用。
　　方法：
　　1、健康雌性Wistar大鼠隨機分為4組，分別為:(1)對照組:假手術(shù)組(sham組，12只);(2)缺血再灌注心律失常模型組（I/R組，12只）;(3)紫檀芪小劑量組（12只）:造模前給予紫檀芪預(yù)處理，20mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共計2周;(4)紫檀芪大劑量組（12只）:造模前給予紫檀芪預(yù)處理，40mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共計2周。
　　2、建立大鼠心肌

9、缺血再灌注模型。
　　3、通過心電監(jiān)護，分別記錄室性心律失常發(fā)生率，室性早搏(VPB)、室性心動過速(VT)發(fā)生率，并進行心律失常評分（VA評分）。
　　4、ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、 IL-1β和SP的表達變化
　　5、檢測大鼠心肌組織中活性氧的含量。
　　6、檢測大鼠心肌組織中谷胱甘肽的活性變化。
　　7、檢測大鼠心肌組織中總超氧化物歧化酶的活性變化。
　　8、Western bl

10、ot檢測Caspase-3蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1、各組大鼠心律失常指標分析:與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠室性心律失常發(fā)生率顯著增加，VPB和VT發(fā)生率增加;與I/R組比較，給予紫檀芪預(yù)處理可顯著降低室性心律失常發(fā)生率，降低VPB、VT的發(fā)生率;且隨著劑量的增加，改變更加顯著，大劑量組與小劑量組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2、紫檀芪對VA評分的影響:說明紫檀芪預(yù)處理可顯著降低心肌缺血再灌注損

11、傷所致的室性心律失常發(fā)生率。
　　3、紫檀芪對大鼠心肌中ROS和SOD的影響:紫檀芪可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮心肌保護作用。
　　4、紫檀芪對大鼠心肌中GSH的影響:隨著紫檀芪劑量的增加，促進GSH表達增高的作用更加顯著。
　　5、紫檀芪對TNF-α和IL-1β的影響:隨著紫檀芪劑量的增加，對TNF-α和IL-1β的抑制作用更加顯著。
　　6、紫檀芪對大鼠心肌中Caspase-3的影響:加入紫檀芪預(yù)處理，可顯

12、著抑制Caspase-3表達，與I/R組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7、紫檀芪對大鼠血清中SP的影響:與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠SP分泌減少;紫檀芪預(yù)處理可顯著促進SP分泌表達，且隨著紫檀芪劑量增加，改變更加顯著，大劑量組與小劑量組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、紫檀芪預(yù)處理可改善心肌缺血再灌注損傷所致的室性心律失常。
　　2、紫檀芪預(yù)處理可抑制心肌缺血再灌注

13、損傷中炎性因子的表達，減少心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護作用。
　　3、紫檀芪預(yù)處理可改善缺血再灌注過程中氧化/抗氧化平衡，增加神經(jīng)多肽SP的表達，減輕心肌缺血再灌注損傷。
　　第三部分 紫檀芪對心肌缺血再灌注中Rho-kinase的影響
　　目的：
　　探討紫檀芪對心肌缺血再灌注中Rho-kinase的影響及其可能的作用機制。
　　方法：
　　1、健康雌性Wistar大鼠隨機分為3組:(1)對照組:假手

14、術(shù)組(sham組，12只);(2)心肌缺血再灌注模型組（I/R組，12只）;(3)紫檀芪作用組(12只):造模前給予紫檀芪預(yù)處理，40mg/kg紫檀芪溶液灌胃，每天1次，共計2周。
　　2、制備大鼠心肌缺血再灌注模型。
　　3、檢測心肌梗死面積:心肌梗死面積的大小表示為AAR的百分比。即心肌梗死范圍=NBT未染色區(qū)/伊文思藍未染色區(qū)×100％
　　4、Real time PCR檢測心肌組織中ROCK1和ROCK2的表達

15、。
　　5、Western blot檢測p-Akt和Rho-kinase的活性變化。Rho-kinase的活性通過檢測其特異性底物肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT-1)的磷酸化水平來表示。
　　結(jié)果：
　　1、Rho-kinase的活性檢測:I/R組中p-MYPT-1表達增加，與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;但在加入紫檀芪預(yù)處理組中p-MYPT-1表達降低，與I/R組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.

16、05)。該結(jié)果提示紫檀芪可抑制缺血再灌注過程中Rho-kinase活性。
　　2、紫檀芪可降低心肌梗死面積:在I/R組中，AAR和心肌梗死面積分別是（54.17±3.73％）和（61.22±4.51％）。紫檀芪預(yù)處理組可顯著降低AAR和心肌梗死面積，分別是（22.17±3.50％）和(41.11±4.65％)，與I/R組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、紫檀芪對ROCK1表達的影響:與假手術(shù)組相比，I/R組

17、中ROCK1表達顯著增加;而紫檀芪預(yù)處理組ROCK1表達降低，與I/R組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、紫檀芪對ROCK2表達的影響:與假手術(shù)組相比，I/R組中ROCK2表達顯著增加（P＜0.05）;而紫檀芪預(yù)處理組未明顯降低ROCK2的表達，與I/R組比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5、紫檀芪對p-Akt的影響;與假手術(shù)組相比，I/R組中p-Akt的表達受到抑制;而紫檀芪預(yù)處理組p-Akt的表達顯著增