人字草抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)及其總黃酮提取物的研究.pdf

1、人字草(Kummerowia striata(Thunb)Schindl.)學(xué)名雞眼草,是豆科(Legumlnosae)雞眼草屬(Kummerowia Schindl.)一年生草本植物。在我國很多地區(qū),民間常用人字草治療炎癥相關(guān)疾病,但未見有關(guān)其抗炎活性物質(zhì)和藥材質(zhì)量等方面的研究?；诖?本研究對(duì)人字草抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)、藥材質(zhì)量進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究,并對(duì)人字草抗炎活性物質(zhì)的制備工藝及初步藥效學(xué)進(jìn)行了探討,為揭示民間植物藥人字草的抗炎作用機(jī)理

2、提供了理論與技術(shù)基礎(chǔ),為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂、藥物制劑的研究與臨床應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
　　 系統(tǒng)檢索了國內(nèi)外有關(guān)人字草的生藥學(xué)、化學(xué)成分、藥理和臨床研究方面的文獻(xiàn),完成了文獻(xiàn)綜述。
　　 建立了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞體外炎癥模型,使用不同濃度的人字草乙醇提取物對(duì)其進(jìn)行干預(yù);ELIsA法檢測(cè)藥物干預(yù)前后上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量,Griess反應(yīng)測(cè)定NO水平;實(shí)時(shí)熒

3、光定量RT-PCR檢測(cè)TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表達(dá);Westernblot法檢測(cè)COX-2和HO-1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明,人字草乙醇提取物具有類似地塞米松的抗炎作用,它可以通過下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和COX-2等炎癥介質(zhì)的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)HO-1的釋放而發(fā)揮一定的抗炎作用。
　　 采用系統(tǒng)溶劑法將人字草乙醇提取物制備成環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇、水4個(gè)溶劑部位,采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型觀察

4、人字草各部位抗炎作用。研究結(jié)果表明,乙酸乙酯部位高低劑量均能明顯減輕小鼠耳腫脹,顯示良好的抗炎作用。進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯抗炎活性部位進(jìn)行化學(xué)成分研究,從中分離鑒定出9個(gè)化合物:β-谷甾醇(β-sitosterol,Ⅰ)、芹菜素(Apigenin,Ⅱ)、山奈酚(Kaempferol,Ⅲ)、槲皮素(Qlaercetin,Ⅵ)、異槲皮苷(Isoquercitrin,Ⅶ)、蘆丁(Rutin,Ⅷ)、木犀草苷(Luteoloside,Ⅹ)、異牡荊素(I

5、sovitexin,Ⅺ)和異葒草素(Isoorientin,Ⅻ)。其中除芹菜素和槲皮素外,其他7個(gè)化合物均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)。
　　 以槲皮素和木犀草素為對(duì)照品,對(duì)人字草藥材進(jìn)行了定性鑒別研究,建立了專屬性鑒別方法。以蘆丁為對(duì)照品,在510nm波長處采用紫外分光光度法測(cè)定人字草和同屬長萼雞眼草中總黃酮的含量。采用反相高效液相法對(duì)人字草水解產(chǎn)物中的槲皮素和木犀草素的含量進(jìn)行了測(cè)定,色譜柱為ZorbaxSB-C18柱(4.6mm×

6、250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.2％磷酸(50:50),檢測(cè)波長360nm,柱溫30℃,流速1.0mL/min。此外,還對(duì)人字草中的異葒草素含量進(jìn)行了測(cè)定,色譜柱為Welchrom.c18柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸(15:85),檢測(cè)波長360nm,柱溫30℃,流速1.0mL/min。結(jié)果表明,人字草中總黃酮的含量約3.32%,槲皮素和木犀草素的含量分別為0.233%和0.032%,槲皮素在

7、5.28.26.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9995(n=5),木犀草素在4.12-20.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9991(n=5);異葒草素的含量為0.305%,異葒草素在8.08～40.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r=0.9999(n=5)。不同采收時(shí)間樣品中總黃酮含量比較結(jié)果顯示,藥材比較合適的采收時(shí)間是8月至9月上旬,這些為藥材的合理采收和質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。
　　 在此基礎(chǔ)上,通過正

8、交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素比較,優(yōu)選了人字草的抗炎有效部位群總黃酮的提取工藝、澄清工藝和純化工藝——藥材用15倍的70%的乙醇回流提取2次,每次1小時(shí),過濾,合并兩次提取的過濾液;將過濾液濃縮至藥材重量與濃縮液體積比為1:6,在60℃水浴條件下,攪拌下加入1.0%的殼聚糖醋酸溶液至含量為0.60%(即100克人字草藥材需加入0.60克的殼聚糖),常溫靜置24小時(shí)后濾過;然后采用D-101型非極性大孔吸附樹脂,樹脂徑高比為1:8,上樣量為4倍BV

9、的人字草溶液(6.0mg/mL),上樣速度2.0mL/min,2倍BV水沖洗后,用4倍BV的80%乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫速度3.0mL/min,洗脫液減壓濃縮,干燥,粉碎,即得人字草總黃酮提取物。
　　 參照人字草藥材質(zhì)量研究的方法,對(duì)人字草總黃酮提取物進(jìn)行質(zhì)量控制研究,測(cè)定了其總黃酮、木犀草素的含量,并進(jìn)行定性鑒別研究,結(jié)果所制人字草總黃酮提取物的總黃酮含量在60%左右,木犀草素的含量在2.4%左右。
　　 采用二甲苯致小