源于植物乳桿菌的抗菌肽Lac-B23基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)研究.pdf

1、抗菌肽因其能夠成為新型食品生物防腐劑而引起了研究者的廣泛關(guān)注，其商業(yè)化的前提是得到足夠數(shù)量的高度純化的抗菌肽，異源表達(dá)是能夠生產(chǎn)抗菌肽的一種行之有效的手段。本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的具有良好活性的菌株Lac-B23為植物乳桿菌素（即抗菌肽）來源，將植物乳桿菌素成功在大腸桿菌中表達(dá)，并同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件和菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高抗菌肽的產(chǎn)量。通過一系列實(shí)驗(yàn)，獲得以下研究成果：
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的植物乳桿菌Lac-B23為

2、實(shí)驗(yàn)菌株，基于PCR方法，篩選出能夠產(chǎn)生單一穩(wěn)定明晰條帶的特異性引物，PCR擴(kuò)增然后膠回收目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行blast比對(duì)，確定克隆得到的該段基因?yàn)榭咕慕Y(jié)構(gòu)基因。以puc57為克隆載體，成功將目的基因與克隆載體相連。連接成功后，通過雙酶切、膠回收獲得目標(biāo)片段；雙酶切表達(dá)載體 pCold，通過 T4連接酶將目標(biāo)片段與pCold連接，并轉(zhuǎn)入嗜冷大腸桿菌中，選用IPTG為誘導(dǎo)劑，使抗菌肽結(jié)構(gòu)基因成功的在嗜冷大腸桿菌中得到表達(dá)。同時(shí)

3、，選取對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)基因表達(dá)影響較大的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)菌體起始濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑 IPTG濃度四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：誘導(dǎo)菌體起始濃度對(duì)重組抗菌肽活性影響最大，OD600=0.8是最適的誘導(dǎo)菌體起始濃度；誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.6mmol/L時(shí)，重組抗菌肽抑菌活性最大；低溫可以有效減少包涵體的形成，高溫不利于形成可溶性蛋白，15℃為最適溫度；誘導(dǎo)時(shí)間為16h時(shí)抑菌活性達(dá)到了最大值，并且誘導(dǎo)時(shí)間變化對(duì)重組抗菌肽的活性具有明顯影響

4、。發(fā)酵條件優(yōu)化表明碳源、氮源及微量金屬離子有利于抗菌肽活性的表達(dá)，葡萄糖濃度在15g/L時(shí)抑菌圈直徑有明顯提高，酵母粉濃度在10g/L時(shí)抑菌圈直徑?jīng)]有明顯提高并且因素不同濃度之間影響并不顯著。鈣離子對(duì)重組抗菌肽的活性有非常明顯的抑制作用，鎂離子和銅離子的影響不顯著，然而，隨著鉀離子濃度的變化，重組抗菌肽的抑菌活性有顯著變化。培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組抗菌肽活性有顯著影響，選取葡萄糖濃度、磷酸二氫鉀濃度、培養(yǎng)時(shí)間作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)三個(gè)因素，優(yōu)化結(jié)果表明：