抗菌肽DCD-1L在大腸桿菌中的表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、目的:Dermcidin(DCD)是德國(guó)科學(xué)家Schittek B等首先在人汗腺中發(fā)現(xiàn)的能特異表達(dá)的基因，DCD-1L是其衍生物，同樣具有廣譜抗菌性，為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。通過(guò)基因工程手段構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-DCD-1L，在大腸桿菌transetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并鑒定其抑菌活性，為進(jìn)一步研究其抗菌機(jī)理及實(shí)踐應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。方法:根據(jù)抗菌肽DCD-1L的基因序列和氨基酸序列，以及大腸桿菌對(duì)密碼子的偏

2、愛(ài)性，人工設(shè)計(jì)并合成了2條DCD-1L基因的寡核苷酸片段，利用這兩條基因片段通過(guò)重疊延伸PCR(overlap extensionPCR)擴(kuò)增出完整的DCD-1L編碼序列，接著用酶切、連接、轉(zhuǎn)化等系列方法將此基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中獲得重組表達(dá)載體pET-32a-DCD-1L，并通過(guò)PCR、雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，將初步驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。將鑒定正確的重組體轉(zhuǎn)化E.coli transetta(DE3)菌株，經(jīng)終濃度0

3、.5mmol/L IPTG在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)后，裂解細(xì)胞后提取蛋白菌液，用SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)狀況，并用抑菌圈實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其表達(dá)活性。結(jié)果:經(jīng)雙酶切分析、DNA測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，證實(shí)DCD-1L基因正確地插入到pET-32a中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-DCD-1L; SDS-PAGE檢測(cè)DCD-1L在28KDa處有目的蛋白條帶，抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌肽DCD-1L對(duì)地衣芽胞桿菌，金黃色葡萄球菌，綠膿桿菌及肺炎鏈球菌均有明