生物素標(biāo)簽序列與耐高溫錯配堿基識別蛋白Tth MutS融合表達與功能鑒定.pdf

1、錯配修復(fù)系統(tǒng)MMR在維持遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性上起重要作用。錯配識別蛋白MutS是MMR系統(tǒng)執(zhí)行修復(fù)功能的第一個蛋白，具有識別并結(jié)合錯配的能力。已經(jīng)有許多報道利用MutS蛋白識別錯配能力檢測突變與SNP，以及增加合成基因保真度的研究。為了克服TthMutS蛋白質(zhì)應(yīng)用于SNP鑒定存在回收率低的缺點，我們表達并鑒定了生物素標(biāo)簽與耐高溫Tth MutS蛋白融合表達的一種基因工程蛋白質(zhì)。將PCR擴增和基因重組技術(shù)制造的編碼這種融合蛋白的DNA片段分別克

2、隆于PinPoint表達質(zhì)粒和pET表達質(zhì)粒。盡管兩種表達系統(tǒng)都能表達該融合蛋白，但是１升LB培養(yǎng)液經(jīng)過相應(yīng)的親和層析純化后所獲得的融合蛋白量不同。pET表達系統(tǒng)能夠產(chǎn)生1毫克以上的融合蛋白，而PinPoint表達系統(tǒng)只能產(chǎn)生100微克的融合蛋白。鏈霉親和素結(jié)合實驗表明C-端融合的TthMutS蛋白質(zhì)不影響生物素標(biāo)簽的生物素修飾，大腸桿菌幾乎能夠完全將這樣的標(biāo)簽序列生物素化。DNA結(jié)合實驗證明，N端的生物素標(biāo)簽序列和C端的His標(biāo)簽序列