綠茶茶多酚EGCG與肝細(xì)胞核受體FXRα-RXRα結(jié)合鑒定.pdf

1、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝臟炎性疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，感染HBV后后嚴(yán)重?fù)p害肝臟并引起其他器官損害及多種并發(fā)癥。目前世界上乙型肝炎的主要治療方法是抗病毒治療。抗病毒治療的關(guān)鍵在于抑制病毒的復(fù)制。實(shí)驗(yàn)研究表明HBV在人體內(nèi)復(fù)制依賴于肝細(xì)胞中的肝富集轉(zhuǎn)錄因子，其中法尼醇X受體(FXR)和視黃醇X受體(RXR)與HBV病毒增強(qiáng)子二區(qū)和核心啟動(dòng)子（HBV ENⅡ&CP）復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)系，進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)XR與RXR可以在被

2、各自的配體激活后形成異物二聚體和HBV結(jié)合，調(diào)控HBV增強(qiáng)子二區(qū)和核心啟動(dòng)子的復(fù)制轉(zhuǎn)錄活性。FXR與RXR有望成為抑制HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的新靶點(diǎn)。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸脂EGCG屬于茶多酚的一種，占兒茶素中60％左右。近年來(lái)研究表明EGCG可以抑制HBV的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，初步試驗(yàn)結(jié)果表明EGCG抑制HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制是通過(guò)結(jié)合FXRα、RXRα，調(diào)控其活性，抑制HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制。
　　本研究構(gòu)建肝細(xì)胞核受體FXRα和RXRα的原核表達(dá)載體pET2

3、8a-FXRα/RXRα，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，加IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western Bloting鑒定確定為FXRα重組蛋白，純化復(fù)性重組蛋白，免疫兔子制備多克隆抗體。同時(shí)構(gòu)建肝細(xì)胞核受體 FXRα、RXRα真核表達(dá)載體 pcDNA3.1-FXRα、pcDNA3.1-RXRα及 pGL-3-HBV ENⅡ& CP Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞，加入各自配體脫氧膽酸（Deoxy

4、cholic acid）、9-順式維甲酸（9-cis）、或與EGCG共同作用細(xì)胞，讀取細(xì)胞中熒光素酶的熒光值，分析FXR/RXR對(duì)HBV ENⅡ&CP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示：只有FXR與RXR共同被配體激活后聯(lián)合上調(diào)HBV ENⅡ&CP的表達(dá)，EGCG可以抑制這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　為進(jìn)一步研究EGCG結(jié)合對(duì)象，采用氨基苯硼酸（PAB）瓊脂糖親和層析法分離EGCG結(jié)合蛋白，Western Bioting鑒定，結(jié)果顯示FXRα/RXRα都

5、與EGCG結(jié)合。DARTS（Drug affinity responsive target stability）實(shí)驗(yàn)：用熱穩(wěn)定的嗜熱菌蛋白酶消化經(jīng)EGCG處理/未經(jīng)EGCG處理的細(xì)胞總蛋白，消化未與EGCG結(jié)合蛋白，Weatern Bloting實(shí)驗(yàn)鑒定蛋白。結(jié)果顯示未消化蛋白為FXRα。因此，EGCG抑制HBV CP&ENⅡ轉(zhuǎn)錄復(fù)制，可能的途徑是通過(guò)與FXRα結(jié)合，改變其分子構(gòu)象，使其不能與HBV基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合，因而不能啟動(dòng)H