具有潛在疫苗價(jià)值的弓形蟲新基因wx2，wx的篩選與鑒定.pdf

1、研究背景： 弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會(huì)致病原蟲，生活史復(fù)雜，涉及的組織器官多，可引起人獸共患的弓形蟲病。其危害嚴(yán)重程度在再現(xiàn)疾病之中僅次于結(jié)核：孕婦感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎，嬰幼兒先天性弓形蟲病，小兒智力障礙等，對(duì)人口素質(zhì)和優(yōu)生優(yōu)育和計(jì)劃生育有嚴(yán)重影響。近年來，弓形蟲腦炎已成為艾滋病患者的主要死亡原因之一；也是器官移植患者死亡和精神病發(fā)病的主要原因之一。危害如此嚴(yán)重，診斷、治療和預(yù)防卻還存在很多問題亟需解決。

2、治療尚無十分理想的藥物，采用的化學(xué)藥物有治療周期長，藥物毒副作用大，不能根治等缺陷，加上至今還無一種藥物能夠殺滅包囊內(nèi)的蟲體，加之弓形蟲的重復(fù)感染十分迅速，故雖經(jīng)多方面的努力，弓形蟲病仍未得以很好地遏制。因此，研制有效的新藥和安全高效的弓形蟲病疫苗，已成為人們的迫切要求，而廉價(jià)、安全、高效的疫苗無疑是最為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的防治措施。弓形蟲病疫苗候選分子的篩選一直是研究中的瓶頸，也是研究的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。本工作在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選、鑒定更有

3、效的疫苗候選基因或藥物分子靶標(biāo)，制備核酸疫苗進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并闡明這個(gè)基因的功能、作用機(jī)制及其潛在的應(yīng)用價(jià)值。 研究目的： (1)通過制備具有保護(hù)性的單克隆抗體，篩選、鑒定弓形蟲病疫苗的新的候選基因。 (2)構(gòu)建該基因的DNA疫苗，觀察其動(dòng)物保護(hù)效果以及對(duì)宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。 (3)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，使獲得的候選基因在轉(zhuǎn)錄后水平沉默，從而使其所表達(dá)的蛋白下降或者缺失，以期進(jìn)一步闡明該基因的功能和作用機(jī)制

4、，對(duì)該基因的應(yīng)用前景進(jìn)行評(píng)估，并希望得到弓形蟲的減毒蟲株，用于制備減毒活疫苗。 研究方法： (1)應(yīng)用雜交瘤技術(shù)獲得抗弓形蟲的單克隆抗體，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察其保護(hù)性效果。以弓形蟲單克隆抗體作為探針免疫篩選弓形蟲速殖子cDNA文庫，獲得其對(duì)應(yīng)的基因序列。經(jīng)Blast(http：∥www.nabi.nlm.nih.gov/BIAST和(http：∥www.toxodb.org/ToxoDB.html.)進(jìn)行同源性比較，登錄Gen

5、Bank并獲得新基因登錄序列號(hào)。 (2)采用雙色免疫熒光抗體定位和真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)等方法對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，應(yīng)用生物信息學(xué)對(duì)基因編碼蛋白的B細(xì)胞表位、氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測和同源性分析。 (3)以攜帶wx2基因的pBluescript7C3一C3質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增基因wx2的ORF；以攜帶wx基因的pBluescript289-G1質(zhì)粒DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得wx基因的ORF，構(gòu)建w

6、x2和wx新基因的DNA疫苗并免疫昆明小鼠，觀察小鼠死亡時(shí)間和檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、脾細(xì)胞CD4+與CD8+淋巴細(xì)胞比值、IFN-γ、血清特異抗體等，以期闡明對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。 (4)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建新基因wx2，wx逆病毒表達(dá)載體，與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-wx2，pcDNA3-wx一起，經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞觀察體外表達(dá)效果；經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，獲得體內(nèi)能持續(xù)表達(dá)siRNA分子的可遺傳的RNA干擾蟲

7、株。采用Western-blotting，RT-PCR，Northern-blotting等方法鑒定其蛋白質(zhì)及BRNA水平變化效果；并對(duì)有基因沉默效果的干擾蟲株進(jìn)行動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)，觀察其的毒力變化：以研究減毒活疫苗的潛在價(jià)值。 研究結(jié)果： (1)獲得了兩株抗弓形蟲的單克隆抗體7C3一C3，289-G1，體外保護(hù)性實(shí)驗(yàn)提示能抑制弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲以及在宿主細(xì)胞內(nèi)的繁殖，其細(xì)胞感染率分別為28％和32％，對(duì)照組為85.2％

8、；50個(gè)HeLa細(xì)胞中納蟲泡內(nèi)平均蟲體數(shù)目為5.18±3.34與5.50±2.36，對(duì)照組為11.12±4.29。被動(dòng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)提示其能夠延長RH株弓形蟲攻擊小鼠的生存時(shí)間(7.2±0.42和7.0±1.41d，對(duì)照組為5.0d)，表明這兩個(gè)單抗具有一定的抗弓形蟲感染的保護(hù)力。 (2)通過免疫篩選弓形蟲速殖子eDNA文庫，獲得了兩個(gè)單抗所對(duì)應(yīng)的基因序列，經(jīng)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們?yōu)樾禄?；GenBank的登錄號(hào)為AY238892和AY2

9、08994。通過雙色免疫熒光定位和體外表達(dá)以及生物信息學(xué)分析對(duì)兩個(gè)新基因進(jìn)行了鑒定，證明WX2為一新的功能膜分子，分子量為49kDa；WX為弓形蟲60S核糖體L7蛋白，分子量為47kDa，位于胞質(zhì)中。 (3)成功構(gòu)建了新基因wx2，wx的真核表達(dá)質(zhì)粒，作為DNA疫苗免疫動(dòng)物顯示peDNA3一wx2與peDNA3-wx能顯著延長弓形蟲RH株攻擊感染的生存時(shí)間，分別達(dá)289.14±46.81h和284.29±47.30h，對(duì)照組僅存

10、活176.4±1.98h和172±1.88h，而且攻擊感染30天后疫苗接種組21只實(shí)驗(yàn)鼠中均有4只小鼠存活，顯示其潛在的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)免疫鼠研究發(fā)現(xiàn)，peDNA3一wx2能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的IFN-γ(P<0.05)；peDNA3-wx2與peDNA3-wx都能使宿主脾細(xì)胞CD4+/CD8+比值下降，及產(chǎn)生特異性抗體，與對(duì)照組相比，P值<0.05；但抗體效價(jià)的高低與保護(hù)力的強(qiáng)弱并不平行；提示該DNA疫苗主要以CD8+的CTL細(xì)胞途徑激

11、發(fā)機(jī)體的抗弓形蟲效應(yīng)。 (4)成功構(gòu)建了5個(gè)針對(duì)基因wx2，wx的干擾表達(dá)質(zhì)粒，獲得了2株部分沉默的RNA干擾蟲株wx2b-i和wxB-i蟲株。經(jīng)過體外表達(dá)以及RT-PCR，Northern-blotting等鑒定，證實(shí)基因wx2，wx mRNA水平及蛋白質(zhì)的表達(dá)均有部分下降。干擾蟲株wx2b-i腹腔接種小鼠后其存活時(shí)間明顯延長，平均存活時(shí)間為235.4±15.4h，陰性組C-i和野生型RH株組分別為161.2±11.98h與1

12、65.4±6.09h，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有顯著性差異，發(fā)病及死亡時(shí)間推遲，表明干擾株的毒力有所降低。 結(jié)論： (1)抗弓形蟲的單克隆抗體7C3-C3，289-G1對(duì)于弓形蟲的感染具有一定的保護(hù)性，能抑制弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲以及在宿主細(xì)胞內(nèi)的繁殖；被動(dòng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)提示能夠延長RH株弓形蟲攻擊小鼠的生存時(shí)間。 (2)WX2為一新的弓形蟲功能膜分子，分子量為49kDa;WX為弓形蟲60S核糖體L7蛋白，分子量為47kDa，定位

13、于胞質(zhì)中。wx2，wx是兩個(gè)較好的弓形蟲疫苗候選分子。 (3)成功建立了含新基因wx2，wx的DNA疫苗，能顯著延長弓形蟲強(qiáng)毒(RH株)攻擊感染動(dòng)物的生存時(shí)間，顯示其潛在應(yīng)用價(jià)值。對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響觀察提示其主要以CD8+的CTL細(xì)胞途徑激發(fā)機(jī)體的抗弓形蟲效應(yīng)。 (4)成功構(gòu)建了5個(gè)針對(duì)基因wx2，wx的干擾表達(dá)載體，并獲得了兩株部分沉默的RNA干擾蟲株wx2b-i、wxB-i，其中wx2b-i蟲株的毒力有所降低，為進(jìn)